Проверка жизнеспособности депонированной культуры микроорганизма из Коллекции эмтк



жүктеу 167.82 Kb.
Дата14.05.2019
өлшемі167.82 Kb.
түріЛекции






Институт химической биологии и фундаментальной медицины

СО РАН

Стр. из 9

Проверка жизнеспособности депонированной культуры микроорганизма из Коллекции ЭМТК

СОП-№ ЛММБ 2-8-2017-09

Дата введения документа:

«_____»_____________201 г.



Действительно до:

«_____»_____________201 г.



Версия № 1

Копия №







Должность

ФИО

Подпись

Дата

Утвердил:

заведующий лабораторией молекулярной микробиологии

Тикунова Н.В.







Согласовали:

с.н.с.

Морозова В.В.







Составил (изменил):

вед. инженер

Бардашева А.В.










СОП-№ ЛММБ 2-8-2017-09

Проверка жизнеспособности депонированной культуры микроорганизма из Коллекции ЭМТК

  1. Введение, цель

Настоящая методика устанавливает порядок проверки жизнеспособности и чистоты культуры микроорганизма, депонированного в КЭМТК ИХБФМ.

  1. Назначение

Проверка жизнеспособности и чистоты культуры депонированного в КЭМТК микроорганизма является основным этапом поддержания Коллекции ЭМТК в рабочем состоянии.

  1. Термины и определения

СОП – стандартная операционная процедура;

Асептика – комплекс мер направленных на предупреждение попадания в рабочую зону сторонних микроорганизмов;

Селективные среды – питательные среды для выделения определенных микроорганизмов за счет создания благоприятных для них условий роста и неблагоприятных условий для сопутствующих микроорганизмов других видов;

РПА – рыбо-пептонный агар;

СМА – сердечно-мозговой агар;

СМБ – сердечно-мозговой бульон.

  1. Пересмотр

Данная СОП вводится впервые.

  1. Материалы и оборудование

    1. Материалы и реактивы

Наименование основных реактивов и материалов

НТД, производитель, страна

РПА

ТУ 9385-012-14237183-07

СМБ

BioMerieux, Франция

Бактоагар

BD, США

Дрожжевой экстракт

BD, США

Триптон

BD, США

Глицерин

ГОСТ 6259-75

Среда Левина

Oxoid, Великобритания

Среда Nutrient Broth

Difco, США

Коринебакагар

ТУ 9398-019-78095326-2006

Среда Китта-Тароцци

Биотехновация, Россия

MRS агар

Himedia, Индия

Сальмонелла, шигелла агар

Oxoid, Великобритания

Агар Мак-Конки без кристаллического фиолетового

BioMerieux, Франция

Солевой агар с маннитом

BioMerieux, Франция

Агар CLED

BioMerieux, Франция

Сабуро агар

BioMerieux, Франция

Дезоксихолатный цитратный агар

Oxoid, Великобритания

Агар Эндо

ТУ 9398-027-78095326

Пробирки типа Eppendorf, 1.5 мл

Thermo, Россия

Наконечники для автоматических дозаторов до 200 мкл

«Eppendorf», США

Спирт этиловый, ректифицированный

ЛРС 000279/10

Перекись водорода, медицинская

ГОСТ 177-88

Вода дистиллированная рН от 5,0 до 7,0.

ГОСТ 6709-72

Натрий хлористый, хч

ГОСТ 4233-77

Чашки Петри, пластиковые диаметр 90 мм

Greiner Bio-One, Австрия

Предметные стекла

Isolab, Германия

Покровные стекла

Стеклоприбор, Россия

Набор красителей по Грамму

БиоВитрум, Россия

Бактериологическая петля пластиковая одноразовая

Citotest, Китай

Автоматическая пипетка вместимостью 20÷200 мкл

«Ленпипет», Россия

Колбы мерные вместимостью 100 мл

ГОСТ 1770-74

Флаконы градуированные c завинчивающейся крышкой, 500 мл

Isolab, Германия

Спиртовка лабораторная

ГОСТ 23932-90Е

Цилиндр вместимость 1 л

ГОСТ 1770-74

Пакеты для стерилизации

Citotest, Китай

Газогенерирующие пакеты, 3,5 л

Oxoid, Великобритания

Пробирки с закручивающимися крынками, 2,0 мл DNase-free, RNase-free

SSIBIO, США


    1. Оборудование

Оборудование

НТД, производитель, страна

Баня водяная лабораторная

BioSan, Латвия

Бокс биологической (микробиологической) безопасности II класс

Lamsystems, Россия

Микроскоп Imager A2

Carl Zeiss, Швейцария

Холодильник

Indesit, Италия

Весы электронные аналитические

Ohaus, США

Термостат суховоздушный лабораторный ТСвЛ-80

ТУ-9452-006-07505566-2006

Анаэростат, 2,5 л

Oxoid, Великобритания

Автоклав ВК-75

ТЗМОИ, Россия

Вортекс

BioSan, Латвия



    1. Комплект спецодежды

Одежда

НТД, производитель, страна

Колпак медицинский

ГОСТ 2313478

Перчатки хирургические резиновые

ГОСТ 3-88

Маска медицинская

ГОСТ EN 13795-1-2011

Халат медицинский

ГОСТ 24760-81



  1. Помещения

Проведение работ осуществляется в боксовых помещениях, в которых находятся ламинарные боксы II класса биобезопасности.

  1. Процедура

    1. Подготовительный этап

7.1.1. Подготовка персонала к проведению работ

– надеть медицинский халат и перчатки



7.1.2. Приготовление дезинфицирующего раствора

– приготовить 3% раствор перекиси водорода, в стеклянный цилиндр налить (100±1) мл 30% перекиси водорода и довести объем до 1000 мл водопроводной водой, данный раствор может быть использован в течение 48 ч;



7.1.3. Подготовка боксового помещения к работе

– обработать 3% раствором перекиси водорода поверхности помещения и оборудования до начала работ;

– обработать ламинарный бокс и помещение ультрафиолетовыми лучами до начала работ в течение 15 мин.

7.1.4. Приготовление 70% раствора этилового спирта

– налить в стеклянный цилиндр (70±1) мл 96% этилового спирта и довести объем до 100 мл дистиллированной водой;



7.1.5. Приготовление LB-среды для хранения культур

– приготовить 50% (об./об.) раствор глицерина в дистиллированной воде;

– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин;

– взвесить (3,0±0,1) г триптона, внести в мерный циллиндр;

– взвесить(1,5±0,1) г дрожжевого экстракта, внести в мерный цилиндр с триптоном. Добавить дистиллированной воды до 300 мл;

– разлить по флаконам градуированным;

– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин;

– смешать в асептических условиях равные объемы среды LB и 50% раствора глицерина;

– разлить в стерильные пробирки объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой по 200 мкл. Инкубировать при (36±1)°С в течение 18 – 24 ч для выявления случайной контаминации.

7.1.6. Приготовление физиологического раствора

– взвесить (0,90,1) г хлорида натрия, внести в мерную колбу вместимостью 100 мл и добавить дистиллированной воды до метки;

– перемешать до полного растворения соли;

– разлить по флаконам градуированным;

– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин.

7.1.7. Подготовка чашек Петри с питательной средой

– приготовить питательную среду согласно инструкции производителя;

– разлить питательную среду после автоклавирования в стерильные чашки Петри толщиной (4,00,5) мм и оставить для застывания при комнатной температуре.

7.2. Основной этап

7.2.1. Посев на неселективные питательные среды

– достать пробирку с соответствующей культурой из коллекционного музея, хранящегося при температуре –20 °С. Бактериологической петлей отобрать небольшое количество суспензии из пробирки и высеять методом истощающего штриха на чашку Петри с питательной средой РПА, СМА для бактериальных штаммов, либо Сабуро-агаром для грибов. Инкубировать чашку согласно условиям, записанным в журнале депонирования микроорганизмов в течение 24 – 72 часов.

– по истечении периода инкубации проверить морфологию колоний на соответствие описанной в журнале депонирования образцов. Для этого изучить морфологию изолированных колоний:

величину колоний (крупные, средние, мелкие, карликовые);

форму колоний (правильная, неправильная, круглая);

прозрачность колоний (прозрачная, непрозрачная);

цвет (бесцветные или окрашенные);

характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, шероховатая);

высоту колоний над поверхностью среды (вдавленная, плоская, возвышающаяся);

край колоний (ровный, неровный);

структуру колонии (гомогенная, негомогенная);

при взятии мазка оценить консистенцию колонии (мягкая, слизистая, сухая);

– микроскопировать нативные мазки и мазки, окрашенные по Грамму согласно разделам 7.2.2. и 7.2.3., из изолированных колоний для суждения об однотипности и соответствии описанному в журнале депонирования микроорганизму;

В случае отсутствия роста культуры из пробирок, хранящихся при –20 °С, обратиться к музею, хранящемуся при –70 °С, и высеять культуру из соответствующих пробирок из этого хранилища. В данном случае, высев проводить как на чашки Петри с агаризованной средой (РПА или СМА для бактерий, Сабуро-агар для грибов), так и в жидкую питательную среду Nutrient Broth для накопления чистой культуры. Инкубировать чашки Петри и пробирки с жидкой средой в условиях, оптимальных для депонированной культуры и описанных в журнале депонирования штаммов. При выявлении роста провести пересев и дальнейшую перезакладку на хранение согласно разделам 7.2.4. и 7.2.5.

В случае полного отсутствия роста культуры считать культуру утерянной.

7.2.2. Микроскопия нативных препаратов

– обжечь предметное стекло в пламени спиртовки;

– нанести небольшое количество стерильного физиологического раствора;

– внести прокаленной бактериологической петлей небольшое количество образца. Петлю обеззараживают прожиганием. Сверху препарат накрыть покровным стеклом;

– микроскопировать, производя первичную идентификацию по морфологическим свойствам;

– погрузить препарат в 3% раствор перекиси водорода после окончания микроскопирования. Экспозиция не менее 6 ч.



7.2.3. Микроскопия мазков окрашенных по Грамму

– обжечь предметное стекло в пламени спиртовки;

– нанести небольшое количество стерильного физиологического раствора;

– внести прокаленной бактериологической петлей небольшое количество образца. Петлю обеззараживают прожиганием;

– оставить предметное стекло на воздухе до полного высушивания;

– провести фиксацию микропрепарата: предметное стекло трижды накладывают на пламя спиртовки в верхней части на 2 секунды с интервалом 4 секунды (суммарно в пламени 6 секунд). Это позволяет убить микроорганизмы, прикрепить их к стеклу и повысить восприимчивость к красителям;

– поместить на мазок полоску фильтровальной бумаги и нанести на фиксированный мазок несколько капель карболового раствора генцианвиолета (реагент 1) и выдержать 2-3 минуты. Слить краску, удалить фильтровальную бумагу и сполоснуть в проточной воде (до 30 сек);

– залить мазок на 1-2 мин раствором Люголя (реагент 2) до почернения препарата;

– слить раствор, мазок промыть дистилированной водой;

– дифференцировать 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают;

– промыть тщательно стекло в дистиллированной воде 1-2 мин;

– окрасить препарат дополнительно раствором сафранина (реагент 3) (несколько капель) в течение 2-3 минут для выявления грамотрицательной группы бактерий;

– промыть в проточной воде и высушить фильтровальной бумагой. Грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет (темно-синий), а грамотрицательные - розово-красный, красный или коричневый;

– микроскопировать, производя первичную идентификацию по морфологическим свойствам;

– погрузить препарат в 3% раствор перекиси водорода после окончания микроскопирования. Экспозиция не менее 6 ч.

7.2.4. Пересев на селективные среды

– обработать рабочую поверхность ламинарного бокса и руки 70% раствором спирта;

– прокалить бактериологическую петлю в пламени спиртовки, остудить, забрать материал с засеянной чашки Петри и засеять методом истощающего штриха чашки Петри с соответствующей селективной питательной агаризованной средой для подтверждения чистоты культуры (таблица 1);

Таблица 1



Селективные среды

Питательная среда

Группа микроорганизмов

Среда Левина

энтеробактерии, стафилококки

Коринебакагар

коринебактерии

Среда Китта-Тароцци

анаэробные микроорганизмы

MRS агар

лактобактерии

Дифференцирующий сальмонелла-шигелла агар

сальмонеллы, шигеллы

Агар Мак-Конки без кристаллического фиолетового

энтеробактерии

Солевой агар с маннитом

стафилококки

Агар CLED

микроорганизмы мочевыводящих путей

Сабуро агар

грибы

Дезоксихолатный цитратный агар

сальмонеллы

Агар Эндо

энтеробактерии

Почвенный агар

почвенные микроорганизмы

– поместить чашки Петри в термостат кверху дном и инкубировать при соответствующих оптимальному росту культуры условиях в течение 18 – 72 ч. Чашки с анаэробами поместить в термостат в анаэростате.

– микроскопировать мазки из чистой культуры.

Далее следовать следующему алгоритму:

– при выявлении несоответствия высеянной культуры описанию исходного штамма взять другую пробирку с данной культурой из музейного хранилища при температуре –20 °С и повторить посев с последующим анализом морфологии колоний и клеток. При соответствии высеянной культуры описанному в журнале депонирования штамму перезаложить культуру на хранение при температуре –20 °С как описано в разделе 7.2.5.

– при несоответствии морфологических данных колоний и клеток с повторного высева из музея при температуре –20 °С депонированному штамму высеять штамм из музейного хранилища при –70 °С. При соответствии высеянной культуры описанному в журнале депонирования штамму перезаложить культуру в оба музея (на хранение при температуре –70 °С и при температуре –20 °С) как описано в разделе 7.2.5.

– при гетерогенности культуры провести три пассажа на селективных средах для изоляции чистой культуры. Полученную чистую культуру вновь идентифицировать согласно СОП ИТП 001 для бактерий или СОП ИТП 002 для грибов и при соответствии нуклеотидных последовательностей ранее секвенированным, перезаложить штамм на хранение под тем же номером.



7.2.5. Закладка на хранение чистых культур

– отобрать достаточное количество материала для хранения с суточных чашек Петри с чистой культурой стерильной пластиковой бактериальной петлей и поместить в пробирки со средой LB, предназначенной для хранения;

– перемешать на вортексе и поместить три пробирки на хранение при температуре –20 °С, три на хранение при температуре –70 °С;

7.3. Завершающий этап

– замочить учтенные чашки Петри в 6% растворе перекиси водорода, избегая образования воздушных пробок. Экспозиция не менее 6 ч.

– обработать 3% раствором перекиси водорода поверхности помещения и оборудования после окончания работ;

– обработать ламинарный бокс и помещение ультрафиолетовыми лучами после окончания работ в течение 15 мин.



  1. Охрана труда и техника безопасности

При проведении процедуры необходимо соблюдать следующие инструкции по технике безопасности и инструкции по биобезопасности:

  1. ИОТ – 02 Инструкция по ОТ для неэлектротехнического персонала по электробезопасности на I квалификационную группу;

  2. ИОТ – 10 Инструкция по ОТ при работе с облучателем бактерицидным ОБНП 2(2х15-01) «Генерис»;

  3. ИОТ – 34 Инструкция по ОТ при работе с ЛВЖ в лабораториях института;

  4. ИОТ – 72 Инструкция по ОТ при работе с перекисью водорода и органическими перекисными соединениями;

  5. ИОТ – 86 Инструкция о мерах ПБ в лабораториях;

  6. ИОТ – 99 Правила работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности и возбудителями паразитарных болезней.



  1. Ссылки

  1. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами. Санитарные правила. СП 1.2.731-99. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999.- 107с.

  2. Донецкая Э. Г.-А. Клиническая микробиология: Руководство для специалистов клинической лабораторной диагностики. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.

  3. Методические рекомендации к проведению практических занятий по дисциплине «Микробиология, вирусология, иммунология» для студентов медико-профилактического факультета/ сост. В.И. Коноплева, Т.М. Гусева: ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, Рязань: РИО РязГМУ, 2015. – 147 с.

  4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ Под ред. М.О. Биргера. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., Медицина, 1982. – 464 с.

Список ознакомления




ФИО

Должность

Дата

Подпись исполнителя

Подпись руководителя

1

2

3

4

5

6




































































































































































































































































































Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет