Российская академия наук



жүктеу 216.82 Kb.
Дата04.03.2018
өлшемі216.82 Kb.
түріАвтореферат


РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА




На правах рукописи

МУРОВЕЦ

Владимир Олегович



Исследование протективного и лечебного действия

креатина и его производных

на сенсомоторные и когнитивные нарушения

при церебральной ишемии у крыс

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в лаборатории физиологии пищеварения



Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук



Поленов Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук



Дудкин Кирилл Николаевич
доктор медицинских наук, профессор

Клименко Виктор Матвеевич

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 25 июня 2007 года в 13 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук

(Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан «___» _______ 2007 г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук Н.Э. Ордян


Общая характеристика работы


Актуальность проблемы. Широкая распространённость ишемического поражения головного мозга и инсультов (Block, 1999), высокая смертность и инвалидизация людей, обуславливающие тяжелые социальные и экономические последствия данных патологий (Жулев и др., 2002), а также практически полное отсутствие патогенетически обоснованных средств их лечения (Broderick, Hacke, 2002; Danton, Dietrich, 2004), определяют неослабевающий интерес к поиску новых подходов в профилактике и лечении указанных острых нарушений мозгового кровообращения, что представляет собой одну из актуальных проблем современной медицины (Гусев, Скворцова, 2001, Danton, Dietrich, 2004).

Известно, что развитие необратимого поражения нервной ткани при ишемии в значительной степени связано с падением уровня высокоэнергетических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) (Самойлов, 1999). Кроме того, происходящее при ишемии снижение внутриклеточного pH дополнительно отягощает положение, ускоряя неферментативное необратимое превращение креатина в креатинин, что резко ограничивает возможность ресинтеза креатинфосфата. Известно также, что креатинфосфат способен поддерживать ресинтез АТФ из АДФ даже в отсутствие кислорода и глюкозы. На основании этого была выдвинута рабочая гипотеза, согласно которой креатин может выполнять роль эффективного нейропротектора. Действительно, в опытах in vitro на переживающих срезах мозга уже было показано, что креатин увеличивает уровень креатинфосфата в нервной ткани и существенно снижает степень аноксического и ишемического поражения нейронов (Balestrino et al., 2002; Balestrino, 2005). В нашей лаборатории впервые в опытах in vivo на модели глобальной ишемии головного мозга было установлено, что интрацеребровентрикулярное введение креатина значительно уменьшает степень нейрональных повреждений у крыс (Polenov et al., 2005). В связи с тем, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) препятствует проникновению экзогенного креатина в мозг (Perasso et al., 2003), а его интрацеребровентрикулярное введение непригодно для использования в клинике, в содружестве с химиками ИВС РАН были разработаны и синтезированы производные креатина, обладающие способностью проникать через ГЭБ. В опытах in vitro, а, в дальнейшем, и в in vivo исследованиях нашей лаборатории были получены приоритеные данные, свидетельствующие о высокой нейропротекторной эффективности одного из них – бензилового эфира креатина (Balestrino et al., 2004; Balestrino, 2005). Результаты этих исследований открывают перспективу для разработки принципиально нового подхода к профилактике и лечению ишемического поражения мозга. Дальнейшая разработка этого направления невозможна без детального исследования влияния креатина и его новых аналогов на когнитивные функции и неврологический статус животных при ишемии головного мозга, чему и посвящена данная работа.



Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось определение эффективности креатина при его интрацеребровентрикулярном введении и новых синтетических производных креатина (глицерилового и бензилового эфиров креатина) при их внутрибрюшинном введении для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:



  1. Выявить неврологические и когнитивные нарушения, возникающие при глобальной и хронической фокальной ишемии головного мозга у крыс.

  2. Исследовать эффекты интрацеребровентрикулярной инфузии физиологического раствора и раствора креатина per se на неврологический статус и когнитивные функции крыс.

  3. Оценить профилактическое и лечебное действие интрацеребровентрикулярного введения креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс. Установить роль осмолярности в эффектах креатина.

  4. Оценить профилактическое действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их внутрибрюшинном введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс.

  5. Оценить лечебное действие глицерилового и бензилового эфиров креатина при их внутрибрюшинном введении на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс.

Научная новизна. Впервые получены экспериментальные доказательства возможности защиты или улучшения функционального состояния (неврологического статуса) и когнитивных способностей у крыс после глобальной (ГИМ) и при хронической фокальной (ФИМ) ишемии головного мозга за счёт интрацеребровентрикулярного (и.ц.в.) введения креатина (Кр), а также внутрибрюшинного (в/б) введения новых синтетических производных Кр (его бензилового и глицерилового эфиров).

Впервые установлено, что профилактическое и.ц.в. введение 50 мМ (но не 100 мМ) раствора Кр, значительно снижает выраженность когнитивных нарушений и эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений у крыс после ГИМ; при этом показано, что данный благоприятный эффект 50 мМ Кр не связан с высокой осмолярностью его раствора.

Впервые установлено, что новое синтетическое производное Кр – глицериловый эфир Кр, значительно (на 50% через 48 ч после ГИМ) снижает степень неврологических расстройств, вызванных ГИМ, при его предварительном (профилактическом) в/б введении. При ФИМ в/б введение глицерилового эфира Кр обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.

Также впервые установлено, что новое синтетическое производное Кр – бензиловый эфир Кр высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ФИМ у крыс при его в/б введении как в профилактической, так и терапевтической парадигмах.



Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы заключается в доказательстве того, что повышение мозгового уровня высокоэнергетических фосфатов с помощью и.ц.в. введения Кр способно ослаблять степень неврологических и когнитивных нарушений, вызванных ишемией головного мозга. Практическая значимость связана с экспериментальным доказательством высокой эффективности новых синтетических производных Кр при их парентеральном введении в отношении ослабления неврологических и когнитивных нарушений в двух моделях ишемии головного мозга, что позволяет рекомендовать их для дальнейшей разработки в качестве перспективных противоишемических препаратов нового класса.

Апробация работы. Материалы исследований докладывались на Юбилейной конференции Института физиологии НАН Беларуси (Минск, 2003 г.); XIX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004 г.); Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина 2005» (Санкт-Петербург, 2005 г.); Humboldt-Kolleg conference: “Technologies of the 21st century” (St. Petersburg, 2005); Третьей международной научно-практической конференции Медбиотек: «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (Москва, 2006 г.); симпозиуме: «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006 г.); семинаре: «Новые технологии – инновационному бизнесу» (Москва, 2007 г).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 журнальные статьи и 7 работ в сборниках трудов конференций, поданы 2 заявки на российский патент.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, иллюстрирована 1 таблицей и 33 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 24 отечественных и 253 иностранных источника.

Материалы и методы исследования


Исследования проведены в хронических опытах на 253 самцах крыс линии Спрэг-Доули массой 290-340 г (Колтуши). Животные содержались в клетках типа Т4 по 4-5 при регулируемом световом (12/12 часов) и температурном режиме, имели доступ к стандартной пище (гранулированный корм, комбинат «Волосово») и воде ad libitum.

Хирургические операции производились совместно с сотрудниками лаборатории физиологии пищеварения ИФ РАН н. с. М.В. Ленцманом и ст. н. с. А.И. Артемьевой. Гистологический анализ материала проводился в НИИЭМ РАМН (чл.-корр. РАМН В.А. Отеллин).

Воспроизведение ГИМ осуществлялась по методу Smith et al. (1984) с модификацией, заключавшейся в 12 минутной окклюзии обеих общих сонных артерий при одновременном контролируемом снижении среднего артериального давления до 50 мм рт. ст. Операция производилась под пентобарбиталовым наркозом (50 мг/кг, в/б).

ФИМ воспроизводилась по методу Tamura et al. (1981) в модификации Bederson et al. (1986) под комбинированным наркозом (кетамин/домитор, в/б 50 мг/кг и 0,2 мг/кг, соответственно) посредством биполярной коагуляции проксимального участка средней мозговой артерии на протяжении 2-3 мм.

Последующее морфологическое исследование подтвердило адекватность выбора моделей ГИМ и ФИМ. ГИМ вызывала у крыс значительные нейроморфологические нарушения, локализованные в гиппокампе (секторы СА1, СА2, СА3), зубчатой извилине, n. caudatus/putamen и неокортексе (Отеллин и др. 2002, 2003); ФИМ вызывала поражение n. caudatus/putamen и гибель значительных участков неокортекса, локализованных в бассейне кровоснабжения левой СМА с образованием рубца (Balestrino, 2005). Выявленные нарушения хорошо согласуются с приводимыми в литературе для ГИМ (Smith et al., 1984; Warner et al., 1990) и ФИМ (Bederson et al., 1986; Garsia et al., 1995).

Для и.ц.в. инфузии крысам под кетаминовым наркозом (125 мг/кг, в/б) в левый латеральный желудочек головного мозга в соответствии с координатами стереотаксического атласа (Pellegrino, Cushman, 1967) имплантировалась канюля из нержавеющей стали. Для непрерывной инфузии растворов использовались осмотические мини-насосы (Alzet osmotic mini-pump, Alzet Corp., USA, модель 1002, объемная скорость инфузии 0,25 мкл/ч), которые размещались подкожно между лопаток. Исследуемые растворы вводились непрерывно в трёх парадигмах: (а) – начиная за 4 дня до и далее в течение 7 дней после ГИМ («предварительное» введение/«профилактическое» применение); (б) – начиная через 30-40 мин после ГИМ и далее в течение 7 дней («лечебное» применение); (в) – в течение 12 дней (контроль эффектов инфузии растворов per se). Для и.ц.в. инфузии использовались: стандартный физиологический раствор (контроль), 50 мМ и 100 мМ (мМ/л) растворы креатина (Кр) и раствор глицерина, с осмолярностью, соответствующей 50 мМ Кр (контроль осмотических эффектов Кр).

Производные Кр, разработанные и синтезированные в рамках совместных исследований с ИВС РАН – глицериловый (ГЭКр) и бензиловый (БЭКр) эфиры Кр (заявки на Росс патент: МПК7 А61К 31/661/1. Приоритет: 02.04.06; МПК7 А61К 31/661/2. Приоритет: 02.04.06, соответственно) потенциально способны проникать через ГЭБ и достаточно стабильны, чтобы допускать в/б введение. Их введение производилось троекратно за 180, 120 и 60 мин до (профилактическое применение) ГИМ или ФИМ, или через 60, 120 и 180 мин (лечебное применение) после ФИМ при разовой дозе 200 мг/кг.

Эвтаназия животных осуществлялась через семь дней после ГИМ/ФИМ методом декапитирования. Мозг извлекался из черепной коробки, помещался в бюкс с фиксирующей смесью (формалин со спиртом) и передавался для гистологического анализа материала.



Поведенческое тестирование

Для исследования когнитивных нарушений применялась пространственная версия водного теста Морриса (ВТМ) (Morris, 1981, 1984) – стандартный тест на исследование процессов обучения и памяти и последствий ишемии головного мозга (Shenk, 1996; Block, 1999; DeVries et al., 2001). Использованная установка ВТМ представляла собой круглый бассейн диаметром 145 см с жесткими стенками высотой 50 см, заполненный на 25 см тёплой водой (t = 24±1°C), которая замутнялась добавлением небольшого количества мела. Бассейн располагался в отдельном помещении с искусственным рассеянным освещением. Обучение в ВТМ начиналось через два дня (48 ч) после ишемии. В течение последующих 6 дней крыса осуществляла поиск скрытой «фиксированной» (расположенной в центре «целевого» 90° сектора/квадранта бассейна) платформы (диаметр 12 см; заглубление 1 см). Ежедневно давалось по 4 попытки на поиск платформы из 4 диаметрально расположенных стартовых точек (выбранных в псевдослучайной последовательности), время поиска ограничивалось 120 с; в течение 30 с между попытками крыса оставалась на платформе. Данные по времени поиска в блоке из 4-х последовательных попыток одного дня усреднялись, формируя обобщенный показатель «навигационных» способностей этого дня. На 6-ой день обучения, через 40-50 мин после последней попытки проводилось 2-х минутное тестирование с видеорегистрацией, оценивающее эффективность когнитивных процессов пространственного обучения и памяти на стадии обучения в тесте – «пробная попытка»; перед этим платформа изымалась из бассейна. С помощью программы анализа видеоизображения (создана в приложении IMAQ Vision в среде LabVIEW 7 (National Instruments, USA) совместно с сотрудником ИФ РАН А.А. Савохиным) вычислялось время, проведённое животным у стенок бассейна (в пределах внешних 20% диаметра бассейна) и в целевом квадранте (в котором располагалась платформа), а также общая длина поискового пути (характеристика средней скорости плавания). Отдельно подсчитывалось количество пересечений окружности («аннулюс»), отмечающей бывшее положение платформы – характеристика точности («аккуратности») поиска.

Для оценки неврологических нарушений, вызванных ГИМ, использовалась 9-бальная шкала Combs and D'Alecy (1987), в модификации Wright et al. (1999). Итоговый балл в ней формируется как сумма баллов в 3-х тестах, оценивающих мышечную силу, хватательный рефлекс и равновесие. При этом 0 баллов свидетельствует о максимальной выраженности нарушений, а 9 баллов – об их отсутствии. Тестирование проводилось трижды: за 1 день, через 2 и 7 дней после ГИМ. Для оценки неврологических нарушений при ФИМ использовались шкала Garcia et al. (1995) и модифицированная шкала оценки тяжести неврологических нарушений (ОТНН) Chen et al. (2001). В шкале Гарсии итоговый балл формируется как сумма баллов за каждый из 6 тестов шкалы на латеральную асимметрию. В шкале ОТНН итоговый балл формируется как сумма баллов за каждый из 4 групп тестов: на моторику, сенсорику, балансирование на приподнятом горизонтальном стержне и оценку наличия определённых рефлексов, припадков, судорог и т.п. Обе шкалы 18-ти балльные, однако, в случае шкалы Гарсии максимальной выраженности нарушений соответствует минимальный балл данной шкалы (3), а для ОТНН, наоборот – максимальный балл – 18. Тестирование проводилось четырежды: за 1 день до, через 1, 3 (72 ч) и 7 дней после индуцирования ФИМ, в обеих шкалах последовательно.

Статистическая обработка и представление данных

Для построения графиков использовался Excel® 2002 (Microsoft Corporation®, USA). Все результаты представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней. Статистический анализ данных проводился с помощью пакета программ Statistica® 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, USA). Статистическая обработка неврологических данных проводилась с применением непараметрических критериев: U критерия Манна-Уитни для межгрупповых и парного критерия Вилкоксона для внутригрупповых сравнений. Анализ данных по ВТМ проводился с использованием двухфакторного (для времени поиска; факторы: внутригрупповой – «день обучения», межгрупповой – «воздействие») и однофакторного (для пробных попыток; один межгрупповой фактор – «воздействие») дисперсионного анализа ANOVA с последующим post-hoc анализом Фишера. Во всех случаях был принят уровень значимости p < 0,05.


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ


Неврологические и когнитивные нарушения, вызываемые глобальной и фокальной ишемией головного мозга у крыс

Использование шкалы Комбса-Д`Алеси позволило выявить динамику неврологических способностей у крыс после ГИМ: значительные неврологические нарушения через 2 дня (резкое, на 80%, падение балла неврологического статуса) и восстановление исходного уровня способностей через 7 дней; полученные данные хорошо согласуются с литературными (Combs, D'Alecy, 1987; Mackensen et al., 2001a.). ФИМ продуцировала у крыс уже более стойкие нарушения: шкалы Гарсии и ОТНН выявляли их как через 24 ч (ухудшение неврологического статуса на 17% и 32%, соответственно), так и через 3 и 7 дней, что также хорошо согласуется с литературными данными (Garcia et al., 1995; Chen et al., 2001).

ГИМ замедляла обучение в водном тесте Морриса (ВТМ): крысы с ГИМ демонстрировали увеличенное время поиска, начиная со второго (при сравнении с ложнооперированными) или первого (при сравнении с интакными) дня обучения (p < 0,05 и ниже). В пробную попытку средняя скорость плавания у них была снижена (p < 0,004), что отражает определённое негативное влияние вызванных ишемией неврологических нарушений. Однако то, что крысы с ГИМ при этом ещё и значительно реже пересекали границы бывшего участка локализации платформы (p < 0,026), свидетельствует о нарушении у них механизмов пространственной памяти и ориентации, т.е. о когнитивных нарушениях. Сопоставление полученных данных с литературными (Pazos et al., 1999, Hartman et al., 2005) позволяет с определенностью заключить, что выявленные нарушения обучения в ВТМ, вызванные ГИМ, в наибольшей степени связаны именно с когнитивными нарушениями.

ФИМ также замедляла обучение ВТМ: крысы с ФИМ демонстрировали увеличенное время поиска платформы по сравнению с ложнооперированным и интакными контролями (p < 0,001). В пробную попытку у крыс с ФИМ наблюдалось увеличенное (p < 0,001) время поиска на периферии бассейна (тигмотаксис), сниженные точность локализации платформы (p < 0,02) и предпочтение целевого квадранта (p < 0,01); при этом по скорости плавания данная группа не отличалась от контрольных. Это подтверждает идею, что ФИМ вызывала нарушения когнитивных процессов; полученные данные хорошо согласуются с литературными (Markgraf et al., 1992; Roof et al., 2001).

Таким образом, использование выбранных неврологических тестов и пространственного водного теста Морриса было адекватно задаче исследования.

Влияние вживления и.ц.в. канюли и инфузии физраствора и креатина per se на неврологический статус и когнитивные способности крыс

Операция имплантирования и.ц.в. канюли сама по себе негативно сказывалась на неврологических способностях крыс даже через 72 ч (8,05±0,22 против 8,56±0,10 балла у интактных; p < 0,05). Инфузия р-ров дополнительно снижала неврологический статус: группы с инфузией физраствора (до 7,44±0,40) и 50 мМ р-ра Кр (6,70±0,50) статистически значимо отличались от интактных (p < 0,01 и p < 0,001, соответственно), но при этом не отличались друг от друга. При этом группа с Кр демонстрировала более высокий уровень нарушений, чем контроль с и.ц.в. канюлей без инфузии (p < 0,05). Это свидетельствует о некотором негативном эффекте Кр при его и.ц.в инфузии, факт, по нашим сведениям, ранее не отмеченный в литературе. Некоторый негативный эффект и.ц.в. инфузии физраствора и р-ра Кр, отмеченный через три дня после её начала, значительно уменьшался с течением времени: ослабевал через 7 и практически исчезал через 12 дней. Вместе с тем, продолжительная и.ц.в. инфузия физраствора или 50 мМ Кр не оказывала выраженного влияния на обучение крыс в ВТМ.



Влияние креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс

Профилактическая эффективность креатина

Профилактическая и.ц.в. инфузия 50 мМ Кр полностью предохраняла от неврологических нарушений, вызванных ГИМ (рис. 1). В то время, как у контроля с инфузией физраствора через 48 ч после ГИМ наблюдалось резкое ухудшение неврологических способностей (на 68%, с 7,44±0,40 до 2,38±0,88; p < 0,05), способности крыс с инфузией 50 мМ Кр (5,67±0,46 балла) были практически на том же уровне, что и до ишемии, т.е. значительно выше, чем у контроля (p < 0,05). Через семь дней после ГИМ возможный позитивный эффект инфузии 50 мМ Кр был замаскирован естественными процессами функционального восстановления. В то же время, профилактическое введение 100 мМ р-ра Кр, хотя несколько и снижало уровень неврологических нарушений через два дня после ГИМ (33% снижение балла, p > 0,37), но при этом замедляло восстановление на больших (через 7 дней) сроках (отличия между группами значимы, p < 0,02).

При обучении в ВТМ после ГИМ, крысы с предварительной инфузией 50 мМ р-ра Кр тратили статистически значимо меньшее время на поиск платформы, чем крысы с инфузией физраствора (p < 0,029, рис. 2) и демонстрировали большую точность локализации платформы в пробной попытке (p < 0,04). Такой положительный профилактический эффект и.ц.в. инфузии Кр на когнитивные способности после ГИМ был показан впервые. В то же время, профилактическое и.ц.в введение вдвое большей дозы Кр – 100 мМ уже не оказывало такого положительного действия, а напротив, имело тенденцию замедлять процессы пространственного обучения.

Контроль осмотических эффектов креатина

Предварительное и.ц.в. введение раствора глицерина не сказывалось на неврологических способностях крыс до ГИМ (8,33±0,71 балла, т.е. уровень интакных), но резко ухудшало их состояние через 48 ч после ГИМ (0,67±0,41 балла) и приводило к гибели большинства (88%) животных через 7 дней после ГИМ. Глицерин фактически блокировал обучение в ВТМ после ГИМ (рис. 2). Таким образом, и.ц.в. инфузия р-ра глицерина эквиосомолярного 50 мМ Кр оказывала разрушительное действие на неврологические и когнитивные способности крыс после ГИМ. Даже увеличение вдвое концентрации Кр оказывало значительно меньшее негативное влияние на обучение. Можно заключить поэтому, что выраженный позитивный эффект 50 мМ Кр не связан с его осмолярностью и, напротив, проявляется даже вопреки этому свойству. И, возможно, именно осмолярность раствора Кр ограничивает его профилактическую эффективность при ГИМ.

Показанная высокая эффективность Кр при предварительном введении в отношении неврологических и когнитивных способностей после ГИМ, хорошо согласуется с морфологическими данными, свидетельствующими о значительном снижении у этих же животных некротических изменений в зонах СА1, СА2, СА3 гиппокампа, зубчатой извилине, n. caudatus/putamen и неокортексе через 7 дней после ГИМ (Отеллин и др., 2002; Поленов и др., 2004; Balestrino et al., 2003; Lensman et al., 2006). Таким образом, Кр обладает высокой нейропротекторной эффективностью в отношении структур мозга, критических как для сенсомоторной координации, так и обучения и памяти.

Терапевтическая эффективность креатина

И.ц.в. инфузия 50 мМ Кр, инициированная через 30 мин после ГИМ, не оказывала выраженных позитивных эффектов в отношении неврологических нарушений и не облегчала когнитивные процессы. Более того, в группах с терапевтической парадигмой и.ц.в инфузии был отмечен повышенный уровень послеоперационной гибели животных (62% и 78% крыс, соответственно с инфузией физраствора и 50 мМ Кр; через 7 дней после ГИМ), превышающий обычный 30-40% уровень. Представляется вероятным, что отсутствие чётких эффектов Кр связано с негативным эффектом начала и.ц.в. инфузии, совпадающим в данном случае по времени с острой фазой развития ишемического поражения мозга, когда мозговые механизмы регуляции не могут справится с дополнительной нагрузкой объёмом, либо, в случае Кр, ещё и с высокой осмолярностью его раствора.




Рис. 1. Влияние предварительной интрацеребровентрикулярной (и.ц.в.) инфузии 50 мМ креатина на неврологический статус крыс после глобальной ишемии головного мозга (ГИМ). На горизонтальной оси отмечены номера тестирований: 1– за 1 день до ГИМ, 2 – через 2 дня и

3 – через 7 дней после ГИМ. Отличия между группами (ANOVA, тест Фишера) обозначены:

** – p<0,01.



Рис. 2. Влияние предварительной (профилактической) интрацеребровентрикулярной (и.ц.в.) инфузии физраствора, 50мМ раствора креатина и эквиосмолярного ему раствора глицерина на обучение крыс в водном тесте Морриса после глобальной ишемии головного мозга. Отмечены статистически значимые отличия (ANOVA, тест Фишера) между группами глицерин и креатин: ** – p < 0,01 и *** – p < 0,001; и между группами физраствор и креатин: # – p < 0,05.


Влияние профилактического внутрибрюшинного введения синтетических производных креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные глобальной ишемией головного мозга у крыс

Новые производные Кр – БЭКр и ГЭКр оказались неспособны снизить негативный эффект ГИМ на обучение в ВТМ. Более того, ГЭКр отчасти усугублял последствия ГИМ. С другой стороны, ГЭКр, в отличие от БЭКр, обладал выраженным профилактическим эффектом в отношении неврологических нарушений, вызванных ГИМ: более чем на 50% снижал их выраженность (через 2 дня после ГИМ). Однако такое его действие было всё же несколько менее выраженным, чем профилактическое действие 50 мМ Кр, полностью устранявшее негативное влияние глобальной ишемии.

Результаты гистологической оценки степени нейрональных поражений мозга этих же крыс, свидетельствуют о выраженном профилактическом нейропротекторном эффекте БЭКр, но не ГЭКр в отношении ГИМ (Balestrino, 2005). Такая ситуация несоответствия результатов неврологического и морфологического исследования неоднократно отмечалась в литературе (например, Mackensen et al., 2001). Учитывая результаты морфологического исследования и относительную нейтральность БЭКр (в отличие от негативных эффектов ГЭКр) в отношении когнитивных нарушений, вызванных ГИМ, можно предположить, что, прежде всего, БЭКр может рассматриваться как перспективный фармакологический агент для дальнейших исследований.

Профилактические и лечебные эффекты синтетических производных креатина на неврологические и когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией головного мозга у крыс

Глицериловый эфир креатина

В тестах шкалы ОТНН крысы с предварительным введением ГЭКр демонстрировали меньшую степень нарушений, чем контроль без инъекций в течение всех дней тестирования после индуцирования ФИМ (на 24% и 39% ниже через 1 и 7 дней). Некоторый лечебный эффект ГЭКр наблюдался уже по данным обеих шкал. После индуцирования ФИМ крысы с ГЭКр демонстрировали меньшие нарушения, чем контроль в каждом тестировании по шкале Гарсии (на 30, 60 и 40%) и через 3 и 7 дней (на 30 и 60%) после ФИМ в шкале ОТНН.

Предварительное введение ГЭКр не влияло на обучение в ВТМ при ФИМ. Однако введение ГЭКр после ФИМ благоприятно сказывалось на когнитивных процессах, связанных с обработкой пространственной информации при хронической ФИМ. Так, данные животные демонстрировали большую степень предпочтения целевого квадранта; значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис.3А) и чаще пересекали границы бывшего участка локализации платформы (рис.3Б).

Бензиловый эфир креатина

Предварительное введение БЭКр практически полностью предотвращало развитие неврологических нарушений у крыс при хронической ФИМ (рис. 4); после ФИМ их неврологический статус был на уровне ложнооперированных (p > 0,22) или интактных крыс. Терапевтическое введение БЭКр также обладало выраженным благоприятным действием: хотя хроническая ФИМ и вызывала некоторое ухудшение неврологических способностей у крыс с БЭКр, уровень нарушений у них был значительно меньшим, чем у контроля, а восстановление происходило быстрее. Через 1 и 3 дня крысы с БЭКр демонстрировали на 50% меньшее снижение неврологического статуса в тестах шкалы Гарсии (p > 0,18) и через 7 дней полностью восстановили пред-ишемический уровень способностей, в отличие от контроля (p < 0,05). По шкале ОТНН данные эффекты БЭКр были менее очевидны. В течение всего периода обучения в ВТМ крысы с предварительным введением БЭКр демонстрировали чёткую тенденцию тратить меньшее время на поиск платформы, чем контрольные животные. В пробную попытку они, в сравнении с контролем значительно меньшее время проводили на периферии бассейна (рис.3А) и точнее локализовали бывший участок расположения платформы (рис.3Б). Хотя введение БЭКр после ФИМ не оказало заметного влияния на стадии обучения в ВТМ, анализ пробных попыток выявил у крыс данной группы сниженное, по сравнению с контролем, время поиска на периферии бассейна (рис.3А) и увеличенную точность поиска (рис.3Б).



Рис. 3. Влияние внутрибрюшинного (в/б) введения бензилового и глицерилового эфиров креатина (ГЭКр и БЭКр) на показатели поискового поведения крыс в пробной попытке (характеристики эффективности пространственного обучения в водном тесте Морриса) при хронической фокальной ишемии головного мозга (ФИМ). Статистически значимые отличия групп с профилактическим или лечебным введением препаратов от контроля с ФИМ но без введения препаратов (ANOVA, тест Фишера) отмечены: * – p < 0,05; *** – p < 0,001.



Рис. 4. Влияние предварительного внутрибрюшинного (в/б) введения бензилового эфира креатина (БЭКр) на неврологические нарушения, продуцируемые хронической фокальной ишемией головного мозга (ФИМ) у крыс. Неврологический статус крыс определялся в соответствии с: А.) – шкалой Гарсии (чем выше балл – тем лучше состояние); Б.) – шкалой ОТНН (чем ниже балл – тем лучше состояние). На горизонтальной оси отмечены номера тестирований: 1– за 1 день до ГИМ, 2 – через 1 день, 3 – через 3 и 4 – через 7 дней после ГИМ. Обозначения: * – p < 0,05; *** – p < 0,001 для межрупповых отличий (U-тест); ## – p < 0,01; ### – p < 0,001 для внутригрупповых отличий от исходного уровня группы ФИМ (критерий Вилкоксона).


Таким образом, БЭКр обладает выраженной профилактической и некоторой терапевтической эффективностью в отношении когнитивных способностей при ФИМ, что и позволяет рекомендовать его для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса.

ВЫВОДЫ


  1. Разработанные модификации моделей глобальной и фокальной ишемии головного мозга вызывают у крыс значительные и воспроизводимые неврологические и когнитивные нарушения.

  2. Вживление интрацеребровентрикулярной канюли, а также интрацеребровентрикулярная инфузия растворов per se оказывают неблагоприятное влияние на неврологический статус, хотя и не влияют на когнитивные функции крыс.

  3. Интрацеребровентрикулярное введение 50 мМ креатина, обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических и когнитивных нарушений, вызванных у крыс глобальной ишемией головного мозга. Данные эффекты креатина не связаны с его высокой осмолярностью.

  4. Новое синтетическое производное креатина –– глицериловый эфир креатина при внутрибрюшинном введении обладает выраженной профилактической эффективностью в отношении неврологических расстройств, вызванных глобальной ишемией мозга. При хронической фокальной ишемии внутрибрюшинное введение глицерилового эфира креатина обладает ограниченной профилактической и терапевтической эффективностью в отношении неврологических нарушений и выраженной терапевтической эффективностью в отношении когнитивных нарушений.

  5. Новое синтетическое производное креатина – бензиловый эфир креатина при внутрибрюшинном введении высокоэффективно в отношении неврологических и когнитивных нарушений при хронической фокальной ишемии мозга у крыс. Его профилактическое введение эффективно предупреждает развитие неврологических нарушений и ослабляет когнитивные нарушения, вызванные фокальной ишемией мозга. Терапевтическое введение, снижая выраженность неврологических нарушений, значимо ускоряет восстановление нормального уровня неврологических способностей и улучшает когнитивные способности при хронической фокальной ишемии мозга.

  6. Результаты данного исследования позволяют рекомендовать бензиловый эфир креатина для дальнейшей разработки в качестве перспективного противоишемического препарата нового класса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Муровец В.О. Исследование протективного действия креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при церебральной ишемии у крыс // Тез. докл. Юбилейной конф. посвященной 50-летию со дня основания Института физиологии Национальной академии наук Беларуси. – Минск. – 2003. – С. 112-113.

  2. Муровец В.О., Ленцман М.В., Артемьева А.И., Золотарев В.А., Поленов С.А. Влияние креатина на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Тез. докл. XIX съезда физиол. общ. им. И.П. Павлова, ч. 1. Рос. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. – СПб. – 2004. Т. 90, № 8, Часть 1. – С. 360-361.

  3. Муровец В.О. Влияние креатина и его производных на сенсомоторные и когнитивные нарушения при ишемии головного мозга у крыс // Сборник материалов Всероссийской конф. молодых исследователей «Физиология и медицина 2005». Вестник молодых учёных (серия «Науки о жизни»). Приложение. СПб. – 2005. – С. 79.

  4. Mourovets V.O., Lensman M.V., Artemieva A.I., Zolotarev V.A., Polenov S.A. Effect of creatine treatment on behavioral consequences of global cerebral ischemia in rats // Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects». Saint-Petersburg. – 2005. P. 63-64.

  5. Polenov S.A., Lensman M.V., Balestrino M., Burov S.V., Otellin V.A., Yakutseni P.P., Artemieva A.I., Mourovets V.O., Izvarina N.L. Development of novel approach for prophylaxis and treatment of brain ischemia and stroke. Alexander von Humboldt Foundation Conference «Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects». Saint-Petersburg. – 2005. P. 72-73.

  6. Муровец В.О., Ленцман, М.В., Артемьева, А.И., Балестрино, М., Поленов, С.А. Креатин эффективен для профилактики неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной ишемией головного мозга у крыс. // Нейронауки. – 2006. – №. 1(3). – С. 20-23.

  7. Lensman M., Korzhevskii D., Mourovets V., Kostkin V., Izvarina N., Perasso L., Gandolfo C., Otellin V., Polenov S., Balestrino M. Intracerebroventricular administration of creatine protects against damage by global cerebral ischemia in rat // Brain Res. – 2006. – Vol. 1114. – P. 187-194.

  8. Ленцман М.В., Коржевский Д.Э., Муровец В.О., Артемьева А.И., Изварина Н.Л., Отеллин В.А., Якуцени П.П., Буров С.В., Балестрино М., Поленов С.А. Оригинально-разработанные препараты на основе креатина, способные предотвращать истощение запасов высокоэнергетических фосфатов в клетках при нарушениях кровоснабжения: новый патогенетический подход к профилактике и лечению ишемии мозга и инсультов // Тез. докл. Третьей международной научно-практической школы-конференции Медбиотек: «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине». – Москва. – 2006. – С. 56-58.

  9. Муровец В.О., Ленцман М.В., Артемьева А.И., Похвощева А.В., Буров С.В., Савохин А.А., Изварина Н.Л., Балестрино М., Поленов С.А. Бензиловый эфир креатина эффективен для профилактики и лечения неврологических и когнитивных нарушений при фокальной ишемии головного мозга у крыс // Тез. докл. Политехнического симпозиума «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона». – Санкт-Петербург. – 2006. – С. 171.



Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет