Состав набора



жүктеу 63.67 Kb.
Дата03.11.2018
өлшемі63.67 Kb.


ООО «Центр Молекулярной Генетики»



Проведение электрофореза

Электрофорез является заключительным этапом проведения ДНК-диагностики. Анализируемые фрагменты ДНК после проведения амплификации или рестрикции наносятся на полиакриламидный гель и после проведения электрофореза результаты визуализируются в УФ свете.


Состав набора





Название реактива

Количество упаковок


Объем реактива

Трис


2

По 108 г.


ЭДТА

2

По 40 мл.


Борная кислота (Н3ВО3)

2

По 55 г.


Акриламид

1

450 г.

Бисакриламид

1

25 г.

Персульфат аммония (ПСА)

5

По 1 г.

ТЕМЕД

1

5 мл.

Краска-буфер для нанесения проб

1

5 мл.

Этидиум бромид

1

2 мл

Маркер молекулярного веса

1

200 мкг

(0,2 мкг/мкл)



Сухие навески реагентов необходимо хранить при комнатной температуре, имеющиеся и приготовленные растворы – при +4 С, маркер молекулярного веса при –20 С.


ООО «Центр Молекулярной Генетики»



Приготовление исходных растворов
Исходными растворами для проведения электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), требующими приготовления, являются:


  • десятикратный раствор электрофорезного трис-боратного буфера (10ХТВЕ). Для приготовления 10ХТВЕ необходимо смешать 108 г Триса и 55 г борной кислоты, добавить 800 мл дистиллированной воды, размешать до растворения реактивов, затем добавить 40 мл ЭДТА и довести объем раствора до 1 литра.




  • 30% сток-раствор смеси акриламида (АА) и бисакриламида (БА) (соотношение указано в Инструкциях к диагностическим наборам) Для приготовления 30% сток-раствора смеси АА/БА необходимо смешать необходимое кол-во исходных реагентов (см. таблицу), добавить 50 мл. дистиллированной воды, размешать до полного растворения реактивов, затем довести объем до 100 мл. Хранить не более 2-х недель!


Соотношение

АА/БА


Акриламида (АА)

гр.

Бисакриламида (БА)

гр.

29 : 1

29

1

29 : 1,3

29

1,3

19 : 1

28,5

1,5




  • 10% раствор персульфата аммония (ПСА). Для приготовления 10% раствора ПСА необходимо в пробирку с сухим ПСА добавить дистиллированной воды 10 мл. Хранить не более 2-х недель!

Остальные реактивы, входящие в набор, готовы к употреблению.


ООО «Центр Молекулярной Генетики»




Приготовление рабочих растворов

Рабочими растворами для проведения электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) являются:


  • однократный раствор электрофорезного трис-боратного буфера (1ХТВЕ). Для приготовления 1 литра однократного буфера необходимо смешать 0,1литр 10ХТВЕ с 0,9 лиртами дистиллированной воды. Раствор перемешать. Приготовленный раствор может использоваться для работы 4-5 раз.




  • раствор бромистого этидия, используемый для окрашивания геля. Для приготовления раствора бромистого этидия, используемого для окрашивания геля после электрофореза (0.5 мкг/мл), необходимо добавить 10-15 мкл исходного раствора Этидиум бромида из набора к 500 мл дистиллированной воды. Приготовленный раствор можно использовать не более 2-х раз.



Проведение электрофореза

    1. Собрать из стекол, спейсеров и гребенки камеру для вертикального электрофореза.

    2. Приготовить акриламидный гель. В зависимости от фрагментов, которые будут разделяться на электрофорезе, используются гели различной процентности (см. Таблицу). Необходимый стоковый раствор указан в Инструкциях.

Для приготовления геля размером 20х20см толщиной 1 мм (объем 45 мл) необходимо смешать:

% геля


30% сток АА/БА (мл)

Н2О(мл)

7

10,5

29,5

8

12

28

9

13,5

26,5



ООО «Центр Молекулярной Генетики»


Добавить 4,5 мл. 10ХТВЕ, 450 мкл. 10% ПСА и 50 мкл ТЕМЕД. После добавления ПСА и ТЕМЕДа смесь тщательно перемешивают и тут же заливают в подготовленную камеру. Оставляют в горизонтальном положении на 20 минут для полимеризации.

    1. После застывания геля, собрать камеру для электрофореза и залить однократный ТВЕ буфер.

    2. Вынуть гребенку, промыть карманы геля ТВЕ буфером, используя пипетку на 1000 мкл с наконечником.

    3. В каждую амплификационную пробирку на стенку добавить по 5 мкл краски-буфера для нанесения проб и центрифугировать 2-3 сек. в микроцентрифуге Vortex.

    4. Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата с буфером для нанесения проб в соответствующей последовательности. Нанести на гель положительный и отрицательный контроли и маркер для определения молекулярного веса фрагментов ДНК (примерно 1-2 мкг.).

    5. Подключить аппарат к источнику тока и провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации при напряжении 270 В.

    6. По истечение необходимого времени, указанного в Инструкциях, вынуть гель из камеры, освободить его от стекол и окрасить в растворе Этидиум бромида в течение 10 минут.

    7. Перенести гель на стекло трансиллюминатора и
      проанализировать результаты. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжевых полос. Появление полос в отрицательном контроле, свидетельствует о контаминации компонентов набора, в этом случае необходимо выяснить
      ее причину, а затем повторить эксперимент.

    8. Полученные результаты документируют с использованием имеющейся программы или фотографированием гелей в УФ свете с использованием оранжевого светофильтра.


Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет