Вирус гепатита с (вгс) был идентифицирован в 1989, как главный агент пострансфузинных гепатитов



жүктеу 63.04 Kb.
Дата07.03.2019
өлшемі63.04 Kb.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ВГС В РАЗЛИЧНЫХ ГРУППАХ ПАЦИЕНТОВ С ГЕПАТИТОМ С В КАЗАХСТАНЕ
Республиканский Центр по профилактике и борьбе со СПИД, Алматы, Казахстан
Земан В.В., Ковтуненко Н.Г., Людвикова Е.К.
Вирус гепатита С (ВГС) был идентифицирован в 1989, как главный агент пострансфузинных гепатитов. В настоящий момент вирусный гепатит С занимает одно из первых мест среди заболеваний печени и является одной из важнейших проблем современной гепатологии. Важнейшей особенностью ВГС является его преимущественно скрытое течение. Более чем 70% случаев заражение ВГС приводит к хронической инфекции, причем заболевание обычно протекает бессимтомно. У большей части хронически инфицированных через несколько лет может развиться цирроз печени, а в 20% случаев -гепатоцеллюлярная карцинома. Современные методы диагностики, такие как выявление специфических антител к ВГС при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), иммуноблотинге (ИБ), обнаружение РНК ВГС методом полимеразной цепной реакции с последующим определением генотипа ВГС позволяет не только выявлять ВГС на более ранних стадиях, но и установить клиническую форму и характер течения заболевания. Одним из наиболее важных моментов обследования пациента- определение генотипа ВГС. Результаты данного исследования влияют на выбор лечения и позволяют прогнозировать его эффективность. Так например, у пациентов инфицированных ВГС 2-го или 3-го генотипа, продолжительность лечения меньше, а эффективность выше, чем у тех, у кого выявлены другие генотипы вируса.
Целью настоящего исследования было изучить частоты распространения различных генотипов ВГС, циркулирующих в различных группах риска на территории Казахстана.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на базе Республиканского Центра по профилактике и борьбе со СПИД. Диагноз гепатита С пациентам ставили на основе повышенного уровня аминотрансфераз, обнаружения специфических маркеров анти-ВГС в сыворотке. Наличие антител в сыворотке крови к вирусу гепатита С (ВГС) определяли ИФА методом с использованием тест-системы Murex anti HCV (version 4.0) производства ABBOT (США). Образцы плазмы, положительные при анализе методом ИФА на наличие антител к ВГС, исследовали в подтверждающей тест-системе – «ВГС-ДСМ» - подтверждающий тест» (Россия), позволяющий проводить определение антител к отдельным белкам вируса гепатита C-core, NS3, NS4, NS5. Исследование проводили с использованием лабораторного оборудования фирмы Tecan (Австрия).



Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли из 100 мкл. сыворотки с использованием гуанин-изоционата и фенол- хлороформной очисткой. В некоторых случаях (для постановки качественной реакции ПЦР РНК ВГС) выделение РНК ВГС из плазмы, сыворотки производили на тест-системах для выделения тотальной РНК «Рибо-сорб» производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (г.Москва)

Проведение ОТ ПЦР. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием тест-системы «Реверта –R-100» (производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ г.Москва) на амплификаторе фирмы Bio-Rad (США). Качественную реакцию ПЦР для выявления наличия РНК ВГС в плазме или сыворотки проводили с использование тест-системы «Ампли-Сенс-100» (производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ г. Москва)

Определение генотипа с помощью ОТ ПЦР. Генотипы ВГС 1a, 1b, 2 и 3a определяли методом ПЦР с использованием тест-системы «Ампли-Сенс-50R HCV-генотип» (производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ г. Москва), в соответствии с инструкции прилагаемой к тест-системе. Определение генотипа проводили во всех образцах, показавших положительный результат детекции РНК ВГС методом качественной ПЦР. В качестве отрицательного контроля использовали ПЦР-буфер без ДНК пробы. Положительные контроли включали образцы кДНК ВГС генотипов: 1a, 1b, 2 и 3a.

Анализ продуктов ПЦР. Продукты ПЦР разделяли при помощи электрофореза в 2% агарозном геле или 6% ПААГ (полиакриламидном геле) в ТБЕ-буфере и окрашивали бромистым этидием. Визуализацию продуктов амплификации осуществляли в УФ-свете.

РЕЗУЛЬТАТЫ


В рамках настоящего исследования образцы больных с подозрением на гепати С, исследовали методами ИФА и ОТ-ПЦР с использованием алгоритма представленного на схеме.
АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ


  1. У больного выявлены антитела к вирусу гепатита С

Исследование проводится методом ИФА с использованием тест-систем 2-го и 3-го поколения


  1. Качественное исследование РНК вируса гепатита С методом ПЦР

РЕЗУЛЬТАТ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ





Продолжается дальнейшее Обследование больного прекращается

обследование больного Повторное исследование ПЦР через 6 мес.




  1. Обязательное определение генотипа ВГС

  2. Количественное ПЦР исследование (определение вирусной нагрузки)



ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛУЧАЯ


Гепатит С



  • Острая инфекция, разрешившаяся инфекция или хроническая инфекция – положительный результат теста анти-ВГС

скрининг ИФA выявил положительный анти-ВГС и подтверждался повторным

ИФA

Далее все анти-ВГС положительные образцы анализировались на присутствие РНК-ВГС методом ПЦР. Все РНК –ВГС положительные образцы были генотипированы.



Ранее в Казахстане проводилось генотипирование ВГС с использованием серологических методов. Нами было проведено генотипирование с использованием метода ПЦР. Анализ строился на генотипировании консервативных участков вирусного генома и определялись наиболее распространенные генотипы ВГС. Всего при таком исследовании нами было выделено 4 генотипа – 1а, 1b, 2 и 3а (рис).
М 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 М 11 12 13 14 15


Рис. Пробы 1,2,5,10,12,13,14 – содержат 1b генотип; 3,4,8,9,15 – 3а генотип; 7- 1а генотип и 8- генотип 2. Амплификация ставилась в два этапа, в первом случае в состав ПЦР-смеси содержались прямой праймер универсальный для генотипа 1 и специфические обратные праймеры для субтипов 1а и 1b; во втором случае - содержались прямой праймер универсальный для всех генотипов ВГС и специфические обратные праймеры для субтипов 2 и 3а. Продукты амплификации в 395 п.н., 338 п.н., 286 п.н., 227 п.н., соответствуют генотипам 1b, 1а, 2 и 3а, соответственно. Распределение частоты встречаемости генотипов в разных группах представлено на трех следующих рисунках.







В группе внутривенных наркоманов без сопутствующей ВИЧ-инфекции наиболее часто встречающимся генотипом оказался 1b генотип, частота его встречаемости составила 0,466. Промежуточное положение по частоте встречаемости заняли генотип 3а с частотой 0,342 и генотип 2 с частотой 0,178. Самым редким генотипом в исследуемой популяции оказался 1а генотип, с частотой встречаемости 0,014. Генетический анализ ВГС у ВИЧ-инфицированных наркоманов показал также преобладание 1b генотипа, частота его встречаемости составила 0,381. Генотипы 3а и 2 встречались в этой группе с частотой 0,333 и 0,214, соответственно. Было также обнаружено сочетание двух генотипов ВГС у нескольких пациентов. Сочетания генотипов ВГС 1b+3а и 1b+2 в данной группе встречались с частотами 0,048 и 0,024, соответственно. В группе больных ВГС не употребляющих внутривенные наркотики распределение частот встречаемости генотипов составило 0,479; 0,233 и 0,221 для генотипов 1b, 3а и 2, соответственно. Наблюдается увеличение доли генотипа 2 за счет снижения 3а генотипа. Частота 1b генотипа ВГС в данной группе не отличается от таковой у внутривенных наркоманов без ВИЧ-инфекции. В группе внутривенных наркоманов с сопутствующей ВИЧ-инфекцией наблюдается увеличение доли 3а генотипа и несколько снижена доля 1b генотипа по сравнению с двумя другими группами. Сочетание генотипов ВГС 1b+3а и 1b+2 в группе больных ВГС не употребляющих внутривенные наркотики обнаружено приблизительно с одинаковой частотой и составило 0,031 и 0,03, соответственно. Генотип 1а в двух последних группах отсутствовал. Таким образом, было показано, что генотип 1b распространен с наибольшей частотой во всех исследованных группах. Наблюдалось увеличение доли 3а генотипа в группе ПИН инфицированных ВИЧ. Однако все различия носили случайный характер при 5% уровне значимости (Р>0,05). Было также показано, что именно у пациентов инфицированных 1b генотипом ВГС хронический гепатит приводит к более тяжелым повреждениям печени и требует более длительного лечения, чем у пациентов, инфицированных ВГС с другим генотипом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ





  • Генотип 1b распространен на территории Казахстана с наибольшей частотой во всех исследованных группах.

  • Наблюдается снижение доли генотипа 1b в группе ВИЧ-инфицированных потребителей внутривенных наркотиков

  • В группе внутривенных наркоманов с ВИЧ-инфекцией наблюдается увеличение доли 3а генотипа.

  • Все различия в распределении частот генотипов в исследуемых группах носят случайный характер (Р>0,05)

  • У пациентов, инфицированных 1b генотипом ВГС хронический гепатит приводит к более тяжелым повреждениям печени, чем у пациентов, инфицированных другими генотипами вирусами

  • Противовирусное лечение пегилированным интерфероном-альфа 2а больных гепатитом с 1b генотипом ВГС требует большей продолжительности независимо от течения болезни

  • При инфицировании 1b ВГС реже наблюдается стойкий вирусологический ответ после противовирусной терапии по сравнению с другими генотипами


Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет