Лабораторна робота Визначення вмісту білків



жүктеу 59.72 Kb.
Дата20.07.2018
өлшемі59.72 Kb.
түріЛабораторна робота

Лабораторна робота

Визначення вмісту білків

В данній роботі кількісне визначення білків ми проводили за методом Бредфорда в модифікації Третьякова Н.Н. Принцип цього методу заснований на утворенні комплексів барвника кумасі блакитного з білками комплексів за рахунок електростатичної взаємодії. Максимум поглинання комплексу у видимій області не співпадає з максимумом поглинання для чистого барвника, що і дозволяє проводити кількісне вимірювання утворених комплексів. З урахуванням специфіки об'єктів дослідження та інших методичних особливостей, в нашій роботі при визначенні білка в методику внесені деякі поправки.

Визначення білків проводили за наступною схемою: до 0,1мг подрібненого на млинарці сухого рослинного матеріалу додавали 2 мл боратного буфера рН=10. Екстракцію білків проводили пртягом однієї години, на холоді переодично помішуючи. Для кожного виду використовували по три повторності для підвищення точності отриманих результатів.

Далі, за методикою Третьякова, екстракт необхідно центригувати 15 хвилин при 12000об/хв. У нашому експеременті добрі показники дає фільтрування через паперовий фільтр (у випадку, коли дослідний матеріал – однорічні пагони дерево-чагарникових рослин), або через ватну пробку (коли досліджується листя). Із фільтрату відібрали 0,2мл, додавали 1мл розчину барвника кумасі через 0,5-1 хвилину вимірювали оптичну густину на ФЕК (кювета 0,3см, довжина хвилі 595нм). Вимірювання проводили проти контролю-0,2мл буфера + 1мл кумасі.

Приготування буратного буфера (рН=10):


  1. бура Na2B4O7·10H2O (м.в.381,43)

Готують 0,05М розчин бури: 19,07г на 1л (19,7г на 100мл)

  1. 0,2м розчин NaOH: 8г на 1л (0,8г на 100мл)

  2. змішують обидва розчини в пропорції:

50мл 0,05М розчину бури

43мл 0,2М розчину NaOH

і доводять до 200мл дистильованою водою.

Приготування розчину барвника:

10мг кумасі (діамантовий голубий G-250),

5мл 95% етанолу,

1омл 85% Н3РО4 – змішати і довести дистильованою водою до 100мл.

Побудова калібрувальної кривої.

Згідно методики калібрувальна крива будується із робочих розчинів.

Останні отримують шляхом розведення ΙΙΙ-го стандартного розчину БСА (бичого сироваткового альбуміну) з концентрацією 0,1 мг/мл. Цей розчин отримують із ΙΙ-го стандартного розчину БСА з концентрацією 1 мг/мл. Початковим розчином (Ι-й вихідний стандартний розчин) служить розчин БСА з концентрацією 10 мг/мл. Схема послідовності розведення стандартних робочих розчинів, згідно методики, наведена нижче.

Ι-й вихідний стандартний розчин БСА, концентрація 10 мг білка/мл.

100мг БСА + 10мл буфера.

ΙΙ-й стандартний розчин БСА, концентрація 1 мг білка/мл.

1мл Ι-го розчину + 9мл буфера.

ΙΙΙ-й стандартний розчин БСА, концентрація 0,1 мг білка/мл.

1мл ΙΙ-го розчину + 9мл буфера.

Таблиця 1. Робочі розчини.


ΙΙΙ-й стандартний розчин БСА, 0,1 мг/мл або 100 мкг/мл

Вміст БСА, мкг

Буфер

Концентрація робочого розчину, мкг/0,1мл

0,2мл

20мкг

0,8мл

2мкг/0,1мл

0,4мл

40мкг

0,6мл

4мкг/0,1мл

0,6мл

60мкг

0,4мл

6мкг/0,1мл

0,8мл

80мкг

0,2мл

8мкг/0,1мл

1,0мл

100мкг

0,0мл

10мкг/0,1мл

У нашій роботі для побудови калібрувальної кривої використовували вихідний розчин бичого сироваткового альбуміну (БСА) з концентрацією 50г білку/МПР, або 0,05г/мл (50 мг/мл, або 5мг/0,1мл). Ι-й стандартний розчин БСА з концентрацією 10 мг/мл отримали шляхом розведення вихідного розчину у 5 разів: 0,2мл вихідного розчину білку + 0,8мл буфера. Отримали 1мл Ι-го стандартного розчину, який містив 10мг білку. У подальшому розводимо його далі буфером у 100 разів (у мірній колбі на 100мл). Отримуємо ΙΙΙ-й стандартний розчин з концентрацією 0,1 мг/мл (або 100 мкг/мл). З цього розчину готуємо робочий розчин за таблицею 2 . Об'єм кінцевого робочого розчину становить 1мл.

Таблиця 2. Кінцевий робочий розчин.


ΙΙΙ-й розчин, концентрація 100мкг/мл (10 мкг/0,1мл)

Вміст БСА в 1мл робочого розчину, мкг

Буфер,мл

Концентрація робочого розчину мкг/0,1мл

Вміст БСА у 0,2мл робочого розчину, мкг

Оптична густина робочого розчину, нм

0,1

10

0,9

1

2

0,104

0,2

20

0,8

2

4

0,089

0,3

30

0,7

3

6

0,128

0,4

40

0,6

4

8

0,124

0,5

50

0,5

5

10

0,168

0,6

60

0,4

6

12

0,190

0,7

70

0,3

7

14

0,225

0,8

80

0,2

8

16

0,251

0,9

90

0,1

9

18

0,272

10

100

0

10

20

0,291

Із робочих розчинів (об'єм 1мл) відбираємо 0,2мл у кювету ФЕКа (0,3см товщина кювети), додаємо 1мл кумасі і вимірюємо оптичну густину через 1 хвилину на ФЕК (595нм).

Калібрувальну криву будували за даними двох останніх колонок таблиці:

по осі ОУ – показники ФЕК (нм),

по осі ОХ – вміст білка в 0,2мл робочого розчину, взятого для вимірювання на ФЕК.

Точки, отримані на графіку робочого розчину за даними таблиці, апроксимували лінійною прогресією. Високе значення коефіцієнта R² = 0,979 свідчіть про достатньо точне приближення експерементальних даних по калібрувальним розчинам до лінійної функції. Отримано рівняння лінійної регресії, яке в подальшому використовувалось для розрахунку кількості білка в дослідних пробах за показниками ФЕК:

У = 0,0023х + 0,0589,

де у – кількість білка (мкг), х – довжина хвилі (нм).



Перерахунок значень вмісту білка в дослідніц пробі.

Кількість білка, що розрахована за калібрувальною кривою, показує вміст білка в 0,2мл фільтрату, взятих для проведення кольорової реакції з кумасі та вимірювання на ФЕК. Загальний об'єм екстракту білка в буфері, отриманого із 0,1г сухого рослинного матеріалу, складає 2мл. Таким чином, кількість білку, отриману за калібрувальною кривою, необхідно збільшити в 10 разів, тобто знайти кількість білка в 2мл буферного екстракту. Результат подаємо в одиницях мкг білку/0,1г сухої речовини.
Каталог: metodi -> fbio -> Biologia
metodi -> «Тәуелсіздік» алаңы 20. 09. 2014 ж сағ. 12. 00
metodi -> Ббк 5. 118. C-85 Рецензенттер
metodi -> «балалар әдебиетін зерттеу» АҚпарат сағаты
metodi -> Экранда слайд көрсетіліп тұрады
metodi -> Ќазаќстан республикасы білім жјне єылым министрлігі
metodi -> Л. Б. Гончаров атындағЫ Қазақ автомобиль жол институты
Biologia -> Факультет: бiологii екологii та медицини
Biologia -> Класифікація І закономірності поширення грунтів
fbio -> Конспект лекцій зі спецкурсу «Іхтіологія»


Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет