Малиновский д. С. Апитоксинотерапия нижний новгород


ГЛАВА 11. ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ



жүктеу 5.72 Mb.
бет20/26
Дата21.04.2019
өлшемі5.72 Mb.
түріМонография
1   ...   16   17   18   19   20   21   22   23   ...   26
ГЛАВА 11. ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ПЧЕЛИНОГО ЯДА
Технологический процесс получения пчелиного яда для нужд фармацевтической промышленности и клинического применения связан не только с непосредственным получением яда, но и с оценкой биологической активности полученных образцов. Биологическая активность пчелиного яда оценивается по его физико-химическим свойствам, токсическому и физиологическому действию, в основе которого лежит специфичность действия на те или иные функциональные системы организма (Хомутов, 1977-2001; Орлов и др., 1980, 1989; Гиноян, Хомутов, 2001; Orlov, Homutov, 1981; Homutov, Orlov, 1998; Orlov, Homutov, Plohov, 1999)

11.1. Идентификация пчелиного яда

Первым этапом оценки биологической активности пчелиного яда является его идентификация, т.е. определение является ли данный образец ядом или фальсификатом. Наиболее простым способом идентификации яда, которым можно пользоваться даже в полевых условиях, является метод, основанный на принципе взаимодействия яда с гепарином.

Практически этот способ осуществляется следующим образом: берут коммерческий раствор гепарина, содержащий в 1 мл 5000 МЕ (1 мг сухого вещества – 130 МЕ гепарина), и разводят физиологическим раствором в 100 раз. Таким образом, в 1 мл приготовленного раствора содержится 50 МЕ гепарина. Из полученного раствора необходимо взять 1 мл и перелить в пробирку. На кончике скальпеля, что соответствует примерно 3 мг яда, взять исследуемое вещество и поместить его в пробирку с гепарином. В том случае, если исследуемое вещество является апитоксином, раствор в пробирке приобретает белый цвет и появляются довольно крупные хлопья, медленно опускающиеся на дно пробирки после встряхивания. В случае присутствия фальсификата после проведения всех указанных операций раствор остается прозрачным (Гиноян, Хомутов, 2001).

Член-корреспондент РАСХН Андрей Николаевич Мельниченко с сотрудниками предложили для идентификации яда микрокристаллографический метод, широко применяемый в аналитической химии. Оказалось, что этот метод позволяет обнаружить характерную физическую структуру пчелиного яда даже в очень малых концентрациях (10-5 – 10-6), если рассматривать под микроскопом подсыхающие на предметном стекле капельки раствора яда (Мельниченко, Капралова, 1969).

Физическая структура пчелиного яда наиболее ясно обнаруживается при переходе раствора от жидкой фазы к твердой. В полностью высохшей капельке раствора эта структура менее заметна, так как яд превращается в непросвечивающуюся порошковидную форму. Характерная физическая структура пчелиного яда представлена системой «сеток» с округленными включениями, более крупные из которых располагаются обычно вблизи нитевидных тяжей или «канальцев» сетки.

При рассматривании подсыхающих капель пчелиного яда в микроскоп с конденсором темного поля наблюдается свечение ее микроскопических структур, которое в люминисцентном микроскопе становится зеленоватым. Из наблюдаемого и всегда однотонного микроскопического строения подсыхающих капелек яда следует, что строение не является артефактом, а объективно отражает элементы физической структуры пчелиного яда (Мельниченко, Капралова, 1969).

Авторами с помощью электронографа было показано наличие в подсыхающих каплях раствора яда наличие кристаллической решетки, сочетающейся с комплексом аморфных включений. На электронограмме отчетливо видна кристаллическая решетка, округленная размытыми концентрическими кольцами, характерными для аморфных тел.

Данный метод отражает видовую специфичность пчелиного яда, так как сравнительная характеристика микрокристаллограмм других ядов показала, что шмели и осы более близки к медоносной пчеле и по их родословным связям, и по орнаменту кристаллизации, чем яд эфы. Химически разрушенный яд пчелы вышеописанных микроскопических структур не имеет. Они не обнаруживаются и в тех случаях, когда пчелиный яд длительное время находится в составе того или иного буфера.

Авторы считают, что открытая ими поликристаллическая структура служит надежным индификатором наличия в растворе пчелиного яда. Вместе с тем, кристаллическая структура, сочетающаяся с определенным комплексом аморфных включений, может служить тонким биофизическим критерием определения видовой принадлежности ядовитых животных (Мельниченко, Капралова, 1969).

Однако нами кристаллической структуры у пчелиного яда не обнаружено. Методом рентгено-структурного анализа с помощью регистрации дифрактометрической кривой было показано, что пчелиный яд имеет аморфную структуру, так как при регистрации сцинцилляционным счетчиком на малых углах не было выявлено ни одного пика, характеризующего кристаллическую решетку яда (рис. 11.1) Таким образом, специфическая решетка отсутствует, а значит методом рентгено-структурного анализа невозможно идентифицировать пчелиный яд (Хомутов, 1987).

Тем не менее, этот метод может быть использован, если к раствору яда добавить гепарин в соотношении 1:0,5. При исследовании гепарина было выявлено наличие трех пиков кристаллизации на углах 22°, 26° и 29° (рис. 11.1). При регистрации дифрактометрической кривой раствора яд-гепарин в указанном соотношении было выявлено наличие двух пиков кристаллизации на 33° и 37° по углам отражения интенсивности рентгеновских лучей (рис. 11.1). Появление на дифрактометрической кривой углов отражения, отличающихся от таковых исходных веществ говорит о появлении нового вещества, что, видимо, связано с взаимодействием яда с гепарином (Хомутов и др., 2001).

Одним из способов идентификации пчелиного яда, менее трудоемким, чем рентгено-структурный анализ, является определение оптической плотности раствора (Орлов, Хомутов и др., 1980; Орлов, Хомутов, Крохмалева, 1980; Хомутов, Орлов, 1987; Хомутов, 1987). Оптическая плотность раствора пчелиного яда меняется в зависимости от концентрации веществ. Однако этот признак не является видоспецифичным и поэтому таким способом нельзя идентифицировать апитоксин.




Рис. 11.1 Дифрактометрическая кривая распределения по углам отражения интенсивности рентгеновских лучей

А – пчелиный яд. В – гепарин. С – яд-гепарин (1:0,5)

Стрелками отмечены рефлексии, характерные для кривых В и С.

Внизу цифрами обозначены углы дифракции.


Добавление гепарина к раствору яда резко повышает оптическую плотность. Можно подобрать такое соотношение в комплексе яд-гепарин, которое дает максимальные изменения оптической плотности, причем для каждого вещества, реагирующего с гепарином, существует специфическая оптимальная концентрация гепарина (Хомутов и др., 2001).

Этот эффект связан с тем, что устойчивость комплексных соединений в растворе определяется константой диссоциации его комплексных ионов. Константа диссоциации характеризует термодинамическую устойчивость комплекса, зависящую от энергии между центральным атомом и лигандом. Сдвиг равновесных (оптимальных) концентраций ионов ведет к разрушению комплексного соединения, что выражается в изменении физико-химических показателей исследуемого раствора (рис. 11.2).



Рис. 11.2. Изменение электропроводности и оптической плотности

исследуемых растворов

1. Электропроводность комплекса гепарин-яд.

2. Электропроводность раствора яда.

3. Электропроводность раствора гепарина

А – Кондуктограмма раствора гепарин-яд

Б – Кондуктограмма раствора яда

В – Кондуктограмма раствора гепарина

При изучении оптической плотности раствора пчелиный яд-гепарин было показано, что максимальное увеличение оптической плотности регистрируется при взаимодействии 1 мг/мл яда с 50 МЕ/мл гепарина (соотношение 1:0,5). При уменьшении концентрации гепарина или его увеличении оптическая плотность была ниже, чем при оптимальном соотношении (рис. 11.2).

Одним из физико-химических методов идентификации пчелиного яда может служить показатель электропроводности раствора гепарин-яд. Исследование электропроводности раствора пчелиного яда (1 мг/мл) показало, что эта величина равнялась 175 сименсам и практически не изменялась в течение всех экспериментов. Электропроводность возрастающих концентраций гепарина (0,05 – 5000 МЕ/мл) увеличивалась со 120 до 200 сим (рис. 11.2).

Электропроводность раствора гепарин-яд изменялась двухфазно, в зависимости от концентрации гепарина в растворе. При увеличении концентрации гепарина в комплексе, где концентрация яда не изменялась, электропроводность снижалась до тех пор, пока его концентрация не достигал 50 МЕ/мл. Дальнейшее увеличение концентрации гепарина сопровождалось повышением электропроводности (рис. 11.2). Характерно, что пик снижения электропроводности совпадает с максимумом оптической плотности, что говорит об оптимальном взаимодействии гепарина с пчелиным ядом именно при данной концентрациим гепарина (Хомутов, 1987).

Оптимальное соотношение при взаимодействии ряда других зоотоксинов с гепарином отличалось от пчелиного яда: для яда гюрзы это соотношение равно 1: 0,0005, для эфы – 1:0,005, для кобры – 1:0,05, для пчелиного яда – 1:0,5 (Хомутов др., 1998). Таким образом, пчелиный яд может быть идентифицирован при добавлении 1 мг/мл к раствору гепарина, содержащему 50 МЕ/мл, причем растворителем в данном случае является дистиллированная вода.

Замена дистиллированной воды, используемой в качестве растворителя, сывороткой крови показала, что при этом происходит отчетливо выраженное потенцирование комплексообразования. Так, если к 1 мг/мл водного раствора пчелиного яда добавить 50 МЕ/мл гепарина, то оптическая плотность увеличивается на 38±0,2% от исходной. Использование в качестве растворителя сыворотки крови увеличивает оптическую плотность на 89±1,2% от исходной, т.е. возрастает более чем в два раза (рис. 11.3).


Рис. 11.3. Зависимость оптической плотности смеси гепарин-пчелиный яд от состава растворителя.

1. CaCl2 ; 2. NaCl; 3. KCl 4. AgNO3


  1. Растворитель – сыворотка крови.

6. Растворитель – дистиллированная вода.
Известно, что в цельной крови содержится 177 мг% калия, 16,2 мг% натрия и 9,7 мг% кальция. Изучение влияния положительно заряженных ионов, наиболее активных в физиологическом отношении, показало, что калий, кальций и натрий способны потенцировать процесс комплексообразования пчелиного с гепарином. Этот процесс является двухфазным и после увеличения концентрации ионов выше оптимальной величины, оптическая плотность раствора снижается (рис. 11.3). Интересно отметить, что ионы серебра, практически отсутствующие в крови, также потенцируют комплексообразование (Хомутов и др., 2001).

11.2. Оценка качества яда

Определение качества сырья, содержащего пчелиный яд, можно проводить методом апитоксиавтографии, описанным В.Н. Крыловым (1995). Этот метод заключается в следующем: сырье, содержащее пчелиный яд в сухом виде, в количестве от 50 до 500 мкг наносят (распыляют) на фотографическую эмульсию, предварительно обработанную активным рассеянным светом в течение 30 с и смоченную водой. Фотоэмульсию с нанесенным сырьем выдерживают 60 с и затем обрабатывают в растворах стандартного проявителя и фиксажа до появления ярко выраженного контраста. При наличии в сырье пчелиного яда на поверхности фотоэмульсии регистрируются следы пчелиного яда в виде пятен низкой оптической плотности (Ошевенский и др., 1989).

Для количественного определения яда готовят шкалу автографов пчелиного яда, по которой путем визуального сравнения с автографом сырья можно определить содержащееся в нем количество пчелиного яда. Минимальная граница чувствительности – 50 мкг яда, при меньшем содержании яда в сырье не удается визуально обнаружить автограф яда. Предельная максимальная граница определения – 500 мкг яда, при большем содержании яда в сырье светлые пятна-автографы сливаются, что препятствует количественному определению яда в сырье.

Шкала автографов для количественного определения яда в сырье заключается в следующем. Готовят смесь из расчета 1 г талька и 1 мг яда. На поверхности стекла равномерно распределяют 50 мг полученной смеси, содержащей 50 мкг пчелиного яда, после чего на эту поверхность накладывают и прокатывают фотобумагу, предварительно обработанную рассеянным светом в течение 30 с и смоченную водой. В этом состоянии фотобумагу выдерживают 60 с, после чего снимают со стекла, промывают водой в течение 30 с (до полного удаления анализируемой смеси) и обрабатывают последовательно растворами проявителя и фиксажа. Весь процесс осуществляется при активном рассеянном свете (естественное освещение). На фотобумаге появляются следы взаимодействия пчелиного яда с фотографической эмульсией в виде пятен округлой формы (Ошевенский и др., 1989).

Для составления шкалы автографов на поверхности стекол равномерно распределяют 100, 150, 200, 500 мг смеси, что содержит, соответственно, 100, 150, 200, 500 мкг яда. Таким образом, получают шкалу автографов пчелиного яда в диапазоне 50 – 500 мкг. Полученная шкала представляет собой зависимость весового содержания яда от количества пятен низкой оптической плотности.

Определение количества пчелиного яда в сырье осуществляется по следующей схеме. На кончике скальпеля берут пчелиный яд, использовавшийся для изготовления вышеописанной шкалы автографов и стандартизованный в соответствии с Фармакопейной статьей «Яд пчелиный». К нему добавляют тальк в соотношении 1:1000. Смесь растирают в ступке, после чего равномерно наносят на стеклянную пластинку и по вышеупомянутой схеме получают автограф яда.

Путем визуального сравнения полученных отпечатков со шкалой автографов обнаруживают то или иное количество стандартизованного пчелиного яда. Далее, на кончике скальпеля берут исследуемое сырье (пчелиный яд-сырец) и готовят смесь с тальком. Получают автограф и сравнивают его с аналогичным автографом стандартизованного яда и со шкалой автографов, определяя количество яда в сырье (Ошевенский и др., 1989).

Позже на основе экспериментальных исследований, был предложен метод, названный авторами «гепариновой пробой» (Хомутов и др., 1998). Суть метода состоит в том, что основное действующее начало пчелиного яда - мелиттин – может вступать во взаимодействие с гепарином, представляющим собой природный мукополисахарид, состоящий из глюкозамина, глюкуроновой кислоты и связанных с ним остатков серной кислоты. Взаимодействие гепарина с мелиттином осуществляется по стехиометрическому принципу, причем оптимальными параметрами взаимодействия являются такие весовые соотношения мелиттин: гепарин, как 2:1 (Хомутов др., 1977, 1987, 1997).

При взаимодействии гепарина с мелиттином in vitro образуется высокомолекулярный комплекс, который значительно изменяет оптическую плотность раствора, причем оптическая плотность тем выше, чем выше концентрация мелиттина в исследуемой жидкости.

Практическое использование описанного эффекта возможно при визуальном сравнении исследуемого образца яда со стандартом. Для этого следует взять 3 мг пчелиного яда, соответствующего стандарту, растворить в 1 мл дистиллированной воды и добавить 1 мл раствора, содержащего 50 МЕ гепарина. Ампулу со стандартом герметично запаивают. Затем 3 мг исследуемого образца пчелиного яда помещается в ампулу такого же объема и конфигурации, добавляется 1 мл дистиллированной воды и 50 МЕ/мл гепарина. Визуальным сравнением стандарта и исследуемого образца оценивается мутность раствора. Если мутность тестового объема исследуемого вещества выше, то следует добавлять дистиллированную воду до тех пор, пока растворы не сравняются по оптической плотности. Биологическая активность яда в этом случае определяется по формуле:

В = (V1/V2) x100, где

В – биологическая активность исследуемого образца яда; V1 – объем раствора, содержащего образец; V2 – объем стандартного раствора.

Для исследуемых образцов пчелиного яда, оптическая плотность которых ниже стандарта предварительно создаются стандарты, содержащие не 3 мг/мл яда, а меньшее количество (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мг/мл). Важно отметить, что для фармацевтической промышленности важно соответствие качества сырья стандарту, поэтому образцы пчелиного яда, активность которых ниже стандарта, не представляют коммерческого интереса (Хомутов и др., 1998).

Несомненно, что для более точной оценки качества пчелиного яда, необходимы лабораторные анализы, дающие более полную картину структуры исследуемых образцов. В 1972 г. И.Г. Солодухо и Н.А. Черепновой был предложен метод электрофоретического анализа. Для этого на стеклянную поверхность пластинки наливается прогретый агар-агар в буферном растворе, после охлаждения на поверхности наносятся желобки, в которые вводят исследуемый раствор. В качестве субстрата авторы предлагают использовать эритроциты, желток куриного яйца, сыворотку. Вполне естественно, что предлагаемые в качестве субстрата биологические объекты, отличающиеся большой вариабельностью, будут вносить ошибку в конечные результаты анализа.

Для устранения этого недостатка метод был модифицирован (Орлов, Хомутов и др., 1989). Предлагаемый метод анализа отличается тем, что в качестве субстрата используется гепарин, образующий с мелиттином яда макромолекулярное соединение. Кроме того, во взаимодействие с гепарином может вступать и гиалуронидаза, а фосфолипаза с гепарином не взаимодействует.

Длина пробега молекулы фосфолипазы при электрофорезе известна. Остается оценить длину пробега макромолекулы гепарин-мелиттин. Чем больше будет относительное содержание мелиттина, тем меньшей электрофоретической подвижностью будет обладать макромолекула комплекса. Если в образце яда будут присутствовать инородные вещества (воск, прополис, нектар, мед, пыльца), процентное содержание мелиттина будет меньше, а электрофоретическая подвижность выше.

Методика осуществляется следующим образом: в агар ставят штампик для лунок, в которые в дальнейшем вносят субстрат, в качестве которого используют гепарин, растворенный в электролите, затем помещают исследуемый образец. Для поддержания рН используют веронал-мединаловый буфер с ионной силой 0,05, который при электрофорезе пускают в электродные пространства. Основная характеристика при электрофоретическом анализе – градиент потенциала. При толщине агаровой пластинки 5 мм в 1% агаре на веронал-мединаловом буфере рН 8,6, ионной силе 0,05, при температуре 20°С применяют следующий режим: градиент потенциала 5 В/см, сила тока 50 мА, время электрофореза 60 мин (Орлов, Хомутов и др., 1989).

Для выявления фракций электрофореграмму помещают в фиксирующую жидкость, а затем окрашивают раствором амидошварца 10Б.

Скорость (U) движущихся молекул связана с напряженностью электрического поля (Е) уравнением Смолуховского:

U= Д х Е х γ / 4П – η, где

Η – вязкость среды, Д – диэлектрическая проницаемость, связанная со структурой молекулы, γ – электрокинетический потенциал.

Метод исследования ультрафиолетовых (УФ) спектров поглощения растворов биологических молекул получил широкое распространение и с определенными ограничениями вполне применим к анализу образцов пчелиного яда. Несмотря на то, что многие вещества имеют широкие перекрывающиеся полосы поглощения в УФ области, метод удобен тем, что отличается достаточной простотой и скоростью. Преимуществом данного метода также можно считать довольно высокую чувствительность (для анализа достаточно несколько сотен микрограммов вещества), а также возможность использования раствора для дальнейшего анализа.

При исследовании спектра поглощения водного раствора пчелиного яда в УФ диапазоне длин волн (180 – 300 нм) наблюдаются пики, характерные для белков и полипептидов. Наибольший максимум поглощения в области 195 нм при концентрации пчелиного яда 0,01 – 0,02 мг/мл сдвигается в красную сторону при увеличении концентрации яда свыше 0,04 мг/мл. Второй пик примерно вдвое меньшей интенсивности более стабилен и соответствует длине волны 220 нм. Оба эти максимума характеризуют пептидные связи в белковых и полипептидных молекулах. Третий пик (длина волны 280 нм) обусловлен наличием остатков ароматических аминокислот (тирозина, фенилаланина и триптофана) в составе молекул пчелиного яда.

При сравнении спектров поглощения растворов пчелиного яда в дистиллированной воде и фосфатном буфере (рН 7,2) можно отметить уменьшение интенсивности первого пика, тогда как остальные два (при 220 и 280 нм) остаются практически без изменения. Это связано, очевидно, с большой интенсивностью поглощения фосфорных солей, входящих в состав буфера, в области 180 – 200 нм. Интересно отметить, что при разведении пчелиного яда в фосфатном буфере первый максимум, соответствующий в этом случае длине волны 204 нм, отличается большей стабильностью в диапазоне концентраций 0,02 – 0,06 мг/мл.



11.3. Стандартизация пчелиного яда

В настоящее время для стандартизации пчелиного яда пользуются в основном Фармакопейной статьей Российской Федерации (ФС 42-2683-96 «Яд пчелиный»), разработанной на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (табл. 11.1).

Таблица 11.1

Показатели качества пчелиного яда по ФС 42-2683-96

«Яд пчелиный» (Крылов, 1995)


Показатели

Требования по ФС

Описание

Белый порошок с желтоватым или сероватым оттенком

Потери в массе при высушивании

Не более 12%

Нерастворимые в воде примеси

Не более 10%

Гемолитическая активность

Не более 480 с

Активность фосфолипазы А

Не менее 100 МЕ

Активность гиалуронидазы

Не менее 70 мМЕ

Часто в практике стандартизации используют описание в устаревших в настоящее время технических условиях (ТУ 46 РСФСР 67-72). Однако, не входящий в ФС токсикологический метод стандартизации, может быть весьма показательным при оценке биологической активности образцов пчелиного яда. При работе с загрязненным ядом следует определять количество фруктозы в образцах пчелиного яда-сырца (Хомутов и др., 1989).



Потери в массе при высушивании. Три навески по 0,1 г каждого образца яда высушивают при температуре 100 - 105°С до постоянной массы. Потери массы при высушивании с точностью до 0,1% вычисляют по формуле:

х = (а – а1)·100 / а, где

х – потери в массе при высушивании (%); а – навеска яда до высушивания (г); а1 – навеска яда после высушивания (г).

Нерастворимые в воде примеси. Три навески по 0,1 г каждого образца пчелиного яда растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Раствор пропускают через высушенный до постоянной массы стеклянный фильтр № 3. Осадок от колбы количественно переносят на фильтр и промывают 50 мл воды. Фильтр с осадком сушат до постоянной массы при температуре 100 – 105°С. Количество нерастворимых в воде примесей вычисляют с точностью до 0,1% по формуле:

У = (Фм – Ф)·100 / н, где

У – количество нерастворимых в воде примесей (%); Фм – масса фильтра с нерастворимыми в воде примесями (г); Ф – масса фильтра (г); н – навеска яда (г).

На содержание золы используют навески 0,1 г, которые сжигают в муфельной печи.

При изготовлении лекарственных форм пчелиного яда возникает необходимость провести перерасчет пчелиного яда, учитывая влажность и нерастворимые в воде примеси по формуле:

Н = Р·100 / 100 – (х + y), где

Н – масса навески пчелиного яда-сырца (г); Р – масса чистого пчелиного яда (г); х – потери в массе при высушивании (%); y – нерастворимые в воде примеси (%).

Определение устойчивости яда к воздействию влаги. Навеску пчелиного яда (0,1 г) помещают в открытую чашку Петри; другой образец (0,1г) в упаковке по ВФС 42-1493-85 без парафинирования помещают на решетку вакуум-эксикатора, где заранее налито 100 мл 15,5% водного раствора серной кислоты. Вакуум-эксикатор закрывают и выдерживают при 40°С в течение 20 дней (что соответствует 1 году хранения при 20°С). Раствор серной кислоты обеспечивает относительную влажность в камере 90% и парциальное давление паров воды 50 мм рт. ст. Контрольные образцы пчелиного яда хранятся при комнатной температуре в упаковке согласно ВФС 42-1493-85. Содержание влаги в образцах определяют соглавсно методике «Потери в массе при высушивании».

Гемолитическая активность. Принцип гемолитического метода заключается в том, что при действии пчелиного яда на отмытые эритроциты последние разрушаются, причем скорость гемолитической реакции (время наступления полного гемолиза) зависит от количества яда.

В результате многочисленных экспериментов был построен калибровочный график для «нативного лабораторного яда» в координатах: количество яда – время полного гемолиза опытной взвеси эритроцитов. График служит для количественного определения яда в исследуемых растворах. Определение проводилось следующим образом: в 5 пробирок, содержащих по 0,5 мл 10%-ой взвеси эритроцитов, добавляли физиологический раствор в количестве 0,45; 0,40; 0,30; 0,10; 0,05 мл и затем исследуемый раствор по 0,05; 0,10; 0,20; 0,40; 0,45 мл соответственно. В контрольную пробирку приливали 0,5 мл физиологического раствора и яд не добавляли.

Эксперимент проводили при постоянной температуре 37°С. За течением реакции следили визуально и отмечали момент наступления полного гемолиза. Процесс считали завершившимся, когда через содержимое пробирки становился ясно виден шрифт, применяемый для стандартизации вакцин. Определив время гемолиза по калибровочному графику, построенному для эталона пчелиного яда, находили количество яда в исследуемом растворе. Нижний предел чувствительности метода – 10 мкг (Черепнова, 1977).

Согласно ФС 42-2683-96 время гемолиза определяют несколько иным способом. Берут навеску пчелиного яда 0,6 г в пересчете на сухой препарат без нерастворимых в воде примесей, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют яд в 0,9% физиологическом растворе и доводят объем тем же раствором до метки, перемешивают (раствор А). 25 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 0,9% раствором хлорида натрия. 0,75 мл приготовленного раствора вносят в кювету фотоэлектроколориметра с толщиной слоя 3 мм, прибавляют 0,75 мл суспензии эритроцитов, перемешивают и выдерживают 15 мин (раствор сравнения). Во вторую кювету с толщиной слоя 3 мм вносят 0,75 мл приготовленного раствора яда, 0,75 мл суспензии эритроцитов, перемешивают и тотчас измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нм. Регистрируют время, в течение которого величина оптической плотности (в течение 3 с) остается постоянной величиной.

Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется следующим образом: 5 мл эритроцитарной массы крови человека или кролика помещают в центрифужную пробирку и прибавляют 5 мл буферного раствора с натрия хлоридом, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Верхний слой сливают. Промывание эритроцитов повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится прозрачной. Отмытые эритроциты в мерном цилиндре разбавляют буферным раствором с хлоридом натрия 1:10. При определении применяют только свежеприготовленную суспензию.

Активность фосфолипазы А. В работах ряда зарубежных авторов использовалась тест-реакция на пчелиный яд, основанная на способности яда задерживать тепловую денатурацию яичного желтка, но способ проведения реакции отличался длительностью. В то же время упомянутая реакция, подобно гемолитической, отличается наглядностью, не требует сложных субстратов и характеризует свойство важного в фармакологическом отношении компонента пчелиного яда – фосфолипазы А.

В связи с этим способность предотвращать тепловую денатурацию яичного желтка была использована для разработки одного из методов его количественного определения, пригодного для использования в производственных условиях. В результате проведенных экспериментов было установлено, что существует ярко выраженная зависимость между временем инкубации, необходимым для предотвращения тепловой денатурации опытной смеси и количеством яда. На основании этих данных была построена калибровочная кривая, позволяющая определять количество яда в исследуемом растворе. Преимуществом предложенного способа, по сравнению с вышеуказанной тест-реакцией, является сокращение времени эксперимента, по крайней мере в 3 раза, что имеет немаловажное значение при работе с большим количеством образцов в производственных условиях. Открываемый минимум яда в пробе 2 мкг (Черепнова, 1977).

На основе фосфолипазного метода разработан экспресс-метод, позволивший сократить время эксперимента до 20 – 30 мин. Было установлено, что при определенном постоянном времени инкубации опытной смеси (субстрата с ядом) для предотвращения ее тепловой денатурации необходимо определенное постоянное количество яда. Было найдено, что при 10-минутной инкубации необходимо 4±0,21 мкг «нативного лабораторного яда». Этот факт лег в основу экспресс-метода, который проводился следующим образом: желточно-буферную смесь разливали по 1 мл в 6 пробирок и добавляли в каждую физиологический раствор соответственно: 0,40; 0,42; 0,44; 0,46; 0,48; 0,50 мл. Полученные смеси помещали в термостат при 37°С. Через 5 мин в 5 пробирок приливали исследуемый раствор пчелиного яда по 0,10; 0,08; 0,04; 0,02 соответственно. В 6-ю – контрольную пробирку – яд не добавляли. Смеси во всех пробирках продолжали инкубировать при 37°С в течение 10 мин и затем помещали в кипящую водяную баню. Эксперименты проводили в трех повторностях. Отмечали наименьшее количество раствора яда, которое предотвращало тепловую денатурацию опытной смеси при 2-минутном кипячении, т.е. содержало, согласно ранее установленному факту, 4 мкг яда (Черепнова, 1977).

Согласно требованиям ФС 42-2683-96 активность фосфолипазы А2 в образце пчелиного яда определяют другим способом. Для этого 1 мл раствора А (см. «Гемолитическая активность») пчелиного яда помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки (раствор Б). В 3 пробирки с притертыми пробками вместимостью 20 мл вносят по 1 мл раствора препарата, 1 мл реактива и 1 мл 10% Z-альфалецитина в этаноле. Пробирки закрывают пробками, встряхивают в течение 30 с и выдерживают в термостате при 37°С в течение 30 мин. Затем во все пробирки прибавляют по 7 мл экстрагирующей смеси, взбалтывают в течение 3 мин и выдерживают при 20°С в течение 1 часа до полного разделения фаз. 3 мл раствора верхнего слоя помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, прибавляют по 5 капель 0,2% раствора тимолового синего в 95% этаноле и титруют его в условиях, исключающих воздействие углекислого газа из микробюретки 0,01 н раствором калия гидроксида в пропаноле-2 до перехода желтого окрашивания в синее, исчезающее в течение 30 с.

Параллельно проводят контрольный опыт, смешивая 1 мл воды, 1 мл реактива и 1 мл 10% раствора Z-альфалецитина в этаноле.

1 мл 0,01 н раствора калия гидроксида соответствует 0,002564 г пальмитиновой кислоты или 10 международным единицам (МЕ) активности фосфолипазы А2 в 1 мин. Активность фосфолипазы А2 на 1 мг яда в мМ/мг/мин или МЕ/мг (х) вычисляют по формуле:

х = (А – А1)·4·0,002564 / а·3·30·0,002564 = (А – А1) ·4 / а·9, где

А – количество 0,01 н раствора калия гидроксида, израсходованное на титрование опытной пробы (мл); А1 – количество 0,01 н раствора калия гидроксида, израсходованное на титрование контрольной пробы (мл); а – навеска пчелиного яда (мг); 4 – количество верхней фазы экстрагирующей смеси в пробе (мл); 3 – объем верхней фазы экстрагирующей смеси, взятой на титрование (мл); 30 – время ферментативной реакции (мин); 0,002564 – количество пальмитиновой кислоты, соответствующее одной МЕ активности фосфолипазы А2 в одну мин (г).



Активность гиалуронидазы. Активность гиалуронидазы (ГАГГ - глюкозоамингликановый комплекс), являющейся обязательным компонентом пчелиного яда, определяется согласно требованиям ФС 42-2683-96, турбодиметрическим методом. В пробирку с 0,5 мл раствора гиалуроната калия добавляют 0,5 мл культуральной жидкости. Затем эту смесь инкубируют 20 мин в водной бане при 37°С. Реакцию останавливают 5-минутным кипячением. После охлаждения в пробирки добавляют по 4 мл подкисленного раствора сыворотки. Через 10 мин измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре (фильтр № 6) против второго контроля.

Первый контроль – к 0,5 мл раствора гиалуроната калия добавляют 0,5 мл стерильной питательной среды, затем смесь инкубируют 20 мин при 37°С, кипятят 5 мин, охлаждают, приливают 4 мл сыворотки и измеряют через 10 мин оптическую плотность.

Второй контроль – к 1 мл фосфатного буфера рН 5,9 добавляют 4 мл раствора подкисленной сыворотки. Уменьшение мутности опытного раствора по сравнению с первым контролем свидетельствует о наличии гиалуронидазной активности у исследуемой культуры.

Активность фермента выражают в условных единицах, принимая показатель экстинции за 100%. Активность гиалуронидазы в опыте соответствует разнице между экстинцией контрольной и опытной проб, выраженной в процентах по отношению к экстинции контрольной пробы:

А = (Ек – Еоп)·100 / Ек, где

А – активность гиалуронидазы; Ек – показатель экстинции контроля; Еоп - показатель экстинции опытной пробы.



Определение сахара (фруктозы) в образцах яда. Согласно мировым стандартам качества в пчелином яде может содержаться до 6% сахаров (Шкендеров, Иванов, 1985). В связи с тем, что ни ТУ, ни ФС не включают методику определения сахара в процесс сертификации, на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского был разработан метод определения фруктозы в образцах пчелиного яда (Хомутов и др., 1989).

Принцип метода заключается в том, что фруктоза в присутствии концентрированной серной или соляной кислоты превращается в оксиметил-фурфурол, который с резорцином образует соединение красно-коричневого цвета. В ходе определения 10 мг пчелиного яда помещают в центрифужную пробирку и растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Для осаждения нерастворяющихся в воде примесей центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в чистую центрифужную пробирку и ко всему объему приливают 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для осаждения белков. Через 5 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин.

В надосадочной жидкости определяют количество фруктозы: 0,1 мл центрифугата помещают в химическую пробирку, добавляют 1,9 мл 20об% соляной кислоты и 2 мл реактива Селиванова. В контрольной пробе содержится 2 мл 20 об% раствора соляной кислоты и реактива Селиванова. Обе пробирки помещают в термостат (80°С) на 8 мин, охлаждают в холодной воде и колориметрируют на фотоэлектроколориметре с длиной волны 530 нм, в кювете с рабочей длиной 10 мм против контроля. Количество фруктозы определяют по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору фруктозы (табл. 11.2).

Ко всем пробиркам приливают 2 мл реактива Селиванова, инкубируют 8 мин в термостате (80°С), охлаждают в холодной воде и колориметрируют на фотоэлектроколориметре (длина волны 530 нм, кювета с рабочей длиной 10 мм). Количество фруктозы в яде в г% рассчитывают по формуле:

0,2хА = % фруктозы в яде, где

0,2 – коэффициент; А – концентрация фруктозы в пробе (мкг).

Таблица 11.2

Построение калибровочной кривой для определения фруктозы

в образцах пчелиного яда


№ пробирок

Концентрация фруктозы в пробе (мкг)

Стандартный р-р фруктозы (мл)

20 об% НCl

(мл)


1

50

0,1

1,9

2

100

0,2

1,8

3

200

0,4

1,6

4

300

0,6

1,0

5

400

0,8

1,2

6

0

0,0

2,0



Токсикологический метод. Дополнительным методом определения биологической активности пчелиного яда может служить определение его токсичности. Определение токсичности производится на белых мышах массой 20 – 22 г. Образец пчелиного яда, предварительно разведенный в физиологическом растворе, вводится внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл.

Животные делятся на 6 групп по 6 особей в каждой. Каждой экспериментальной группе вводится яд в дозе 2, 4. 6, 8 и 10 мг/кг живого веса соответственно. Через 24 часа учитывается число погибших и выживших особей в каждой группе. Средняя доза яда, сопровождающаяся гибелью 50% животных (ЛД50) рассчитывается методом пробит-анализа Миллера и Тейтнера (Беленький, 1963).



Хроматографический метод. Наиболее важным из параметров, характеризующих качество пчелиного яда, является определение количественного содержания наиболее значимых компонентов в яде. Наиболее точно это достигается путем хроматографического разделения цельного яда на составляющие фракции. Яд растворяется в определенном растворе и пропускается в таком состоянии через колонку, заполненную веществом, которое адсорбирует компоненты яда. Дело в том, что такая адсорбция различна для разных компонентов из-за их различия в массе, электрическом заряде молекул, отношению их к растворителю.

В результате на выходе из колонки разные компоненты (фракции) будут выходить в разное время. Пользуясь этим, порции раствора, разделенные во времени, можно направить в соответсвующий анализатор, где определяется количество той или иной фракции яда. При этом, чем сложнее аппаратура, тем большее количество фракций можно выявить и проанализировать. В современных жидкостных хроматографах вышеуказанные процессы автоматизированы и на выходе дается машинная распечатка содержания того или иного компонента яда.

Указанный метод хроматографического разделения пчелиного яда на компоненты является удобным не только для анализа яда, но и для промышленного (препаративного) получения этих компонентов. Для этого необходимо увеличить объем колонок и скорость пропускания через них раствора, что, в свою очередь, можно осуществить увеличивая давление на входе колонки (Крылов, 1995).

Приготовление растворов.

1. 0,05% раствор гиалуроната калия в 1/15 М фосфатном буфере рН 5,9, содержащем 0,2 М хлористый натрий (гиалуронат калия растворяют при встряхивании и нагревании до температуры 30 - 35°С).

2. Нормальная сыворотка крови кролика без консерванта, разведенная в 10 раз 0,2 М ацетатным буфером рН 4,7. Непосредственно перед опытом сыворотка подкисляется ледяной уксусной кислотой до рН 3,5.

3. Буферный раствор с натрия хлоридом. К 450 мл 0,9% раствора хлорида натрия прибавляют 50 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,4. Раствор хранят в холодильнике.

4. Реактив 1. 0,1 г альбумина растворяют в 80 мл 0,05 М раствора трис-буфера рН 8,0, прибавляют 2 мл 0,05 М раствора трилона Б, 0,4 мл 50% раствора кальция хлорида и доводят объем раствора 0,05 М трис-буфером до 100 мл. Реактив хранят в прохладном месте в течение 6 дней.

5. 0,05 М раствор трис-буфера рН 8,0. 24,3 г 3-оксиметиламинометана растворяют в 500 мл дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 25 мл приготовленного раствора смешивают с 40 мл 0,1 н раствора соляной кислоты и объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл, рН 8,0 (потенциометрически при 20°С). Раствор хранят в прохладном месте в течение 30 дней.

6. Экстрагирующая смесь. 300 мл гексана смешивают с 200 мл 95% спирта и прибавляют 1 мл 3 н серной кислоты. Смесь хранят в бутылке с притертой пробкой в прохладном месте в течение 30 дней.

7. 0,1 н раствор калия едкого в изопропиловом спирте. 0,7 г калия едкого растворяют в 100 мл изопропилового спирта, раствор оставляют на 24 часа. Затем сливают прозрачную жидкость с осадка. Раствор хранят в склянках с резиновыми пробками в защищенном от света месте в течение 30 дней.

8. 0,01 н раствор калия едкого в изопропиловом спирте. 10 мл 0,1 н раствора калия едкого в изопропиловом спирте разбавляют изопропиловым спиртом до объема 100 мл. Титр раствора устанавливают по 0,01 М раствору пальмитиновой кислоты в гептане. Раствор хранят 1 день.

9. 0,01 М раствор пальмитиновой кислоты в гептане. 0, 2564 г пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл гептана нормального. Раствор хранят в прохладном месте 3 месяца.

10. 3 н раствор серной кислоты. 7,5 мл концентрированной серной кислоты разбавляют водой до 100 мл.

11. Ацетатный буферный раствор. Раствор 1. В мерной колбе вместимостью 1 л растворяют 13,8 г натрия ацетата в 200 мл воды, прибавляют 8,5 г натрия хлорида и доводят объем раствора водой до метки.

12. Фосфатный буфер с рН 7,40. К 81,8 мл раствора Na2НРО4 х 2Н2О доливают до 100 мл раствор КН2РО4.

13. 0,8 М раствор тетрабората калия. 4,5% раствор калия едкого: 45 г калия едкого растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1 л. 49,5 г борной кислоты помещают в химический стакан вместимостью 2 л, приливают 1 л воды и постепенно при постоянном перемешивании, прибавляют 4,5% раствор калия едкого до полного растворения борной кислоты. Полученным раствором калия тетрабората отфильтровывают 20 мл ацетатного буферного раствора до рН 8,9. По титру находят количество калия тетрабората, который необходимо добавить к реакционной смеси, чтобы ее рН был равен 8,9. Обычно это количество составляет 0,2 мл. Раствор хранят в прохладном месте в течение 6 месяцев.

14. Раствор реактива Эрлиха. 10 г перекристаллизованного диметиламинобензальдегида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, приливают 12,5 мл концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора ледяной уксусной кислотой до отметки. Реактив хранят в прохладном месте в течение 3 месяцев. 1мл полученного раствора разводят ледяной уксусной кислотой (1:9). Раствор применяют свежеприготовленным.

15. Раствор глюкозамина (N-ацетил-Д-глюкозамин). 10 мг перекристаллизованного глюкозамина вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки ацетатным буферным раствором. 1 мл этого раствора содержит 1,82 мкМглюкозамина. Из него разведением в 5, 6, 7, 21 раз готовят растворы для построения калибровочного графика. Растворы применяют свежеприготовленными.

16. 0,2% раствор гиалуроновой кислоты. 0,02 гиалуроновой кислоты марки Б растворяют в 10 мл ацетатного буферного раствора. Раствор хранят в прохладном месте не более 6 дней.

Литература

Беленький М.А. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. – М.: Медгиз, 1963. – 152 с.

Гиноян Р.В., Хомутов А.Е. Простой способ идентификации пчелиного яда //Пчеловодство, 2001, № 2. С.51-52.

Гиноян Р.В., Хомутов А.Е. Технология получения пчелиного яда-сырца в промышленных масштабах. – Н. Новгород: ННГУ, 2001.-174с.

Гиноян Р.В., Хомутов А.Е. Методы стандартизации пчелиного яда. – Н. Новгород: ННГУ, 2001.-70с.

Крылов В.Н. Пчелиный яд. - Н.Новгород: ННГУ, 1995. – 223с.

Мельниченко А.Н., Капралова О.В. Видовая специфичность физической структуры пчелиного яда // Матер. XXII Международного конгресса по пчеловодству. – Бухарест: Апимондия, 1969. – С. 89-92.

Орлов Б.Н., Хомутов А.Е., Корнева Н.В., Бажутина Г.А. Метод качественного и количественного определения некоторых зоотоксинов в биологических жидкостях // Анализ окружающей среды. – Горький, 1980. - С. 55-57.

Орлов Б.Н., Хомутов А.Е., Крохмалева Н.А. Фотометрический метод определения гепарина в жидкости // Анализ окружающей среды. – Горький, 1980. - С. 77-79.

Орлов Б.Н., Хомутов А.Е., Ягин В.В. Способ определения биологической активности яда. - Авторское свидетельство СССР № 1501719 от 15.04.89.

Ошевенский Л.В., Крылов В.Н.. Киселев Н.И. Технология получения пчелиного яда. Апитоксиграфический метод контроля качества сырья // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине. – Горький, 1989. – С. 53-57.

Солодухо И.Г., Черепнова Н.А. Способ анализа биохимически активных веществ. – Авторское св-во СССР № 323726 от 7. 11. 1972.

Хомутов А.Е. К механизму взаимодействия гепарина с некоторыми нейротропными средствами // Механизмы действия зоотоксинов. Межвузовский сборник. – Горький: ГГУ, 1977. – С. 92-95.

Хомутов А.Е. Гепарин и зоотоксины // Механизмы действия зоотоксинов. Межвузовский сборник. – Горький: ГГУ, 1987. – С. 14-31.

Хомутов А.Е., Звонкова М.Б., Пахомова М.Е. Полифункциональные свойства гепарина //Вестник ННГУ. Серия биологическая. - Н.Новгород, 2001. С.128-134.

Хомутов А.Е., Лашина В.Л., Калашникова Л.М. Технология получения пчелиного яда-сырца. Методы оценки качества пчелиного яда-сырца // Биологические ресурсы пчеловодства и их рациональное использование в народном хозяйстве и медицине. Межвузовский сборник. Горький: ГГУ, 1989. – С. 48-53.

Хомутов А.Е., Калашникова Л.М., Зимина Т.А., Орлов А.В. Экспресс-метод анализа пчелиного яда //Химия для медицины и ветеринарии. Сборник научных трудов. Саратов, 1998. С.205-207.

Хомутов А.Е., Орлов Б.Н. Физиологическая роль гепарина. Методическое пособие. – Горький: ГГУ, 1987. – 87с.

Хомутов А.Е., Орлов А.В., Дерюгина А.В., Калашникова Л.М., Зимина Т.А. Средство от ужалений //Пчеловодство, 1999, №1. С.60-61.

Хомутов А.Е., Орлов А.В., Мухина И.В. Антитоксические свойства гепарина //Перспектива развития Волжского региона. Материалы Всероссийской конференции. Тверь, 1999. С.218-119.

Черепнова Н.А. Биологические основы стандартизации пчелиного яда и его лекарственных препаратов // Механизмы действия зоотоксинов. - Горький, 1977. – С. 57-75.

Шкендеров С., Иванов Ц. Пчелиные продукты. - София: Земиздат, 1985. – 280с.

Homutov A.E., Orlov A.V. Reduction of heparin toxic effect of melittin on work of the isolated heart of rat //8-th Inter. Symposium on Apitherapy. Slovenia, 1998. P.89-91.

Orlov B.N., Homutov A.E. Heparin – antagonist of bee venom //26 Inter. Apicultural. Congress. - Bucharest: Apimondia, 1981. - P. 494.

Orlov A.V., Homutov A.E., Plohov R.A. The mechanism of bee venom and heparin interaction //XXXVI Inter. Apicultural Congress. Bucharest: Apimondia, 1999. P.128-130.

ЧАСТЬ III. АПИТОКСИНОТЕРАПИЯ
Апитокситенорапия является одним из звеньев апитерапии, заключающейся в использовании в клинической практике не всех продуктов пчеловодства, как это характерно для апитерапии, а только пчелиного яда в виде ужалений или препаратов, в состав которых входит пчелиный яд.

Биохимические и фармакологические исследования показали, что пчелиный яд содержит компоненты, обладающие разнообразными противовоспалительными свойствами, часть которых свойственна гормональным (глюкокортикоидным) противовоспалительным средствам, а другая часть - нестероидным противоревматическим средствам (Шкендеров, Иванов, 1985).

В воспалительном процессе принимают участие большое количество эндогенных веществ и клеточных элементов. Это означает, что эффективные противовоспалительные средства должны обладать способностью угнетать или нейтрализовать действие этих носителей или посредников воспалительной активности. Ввиду того, что ни одно лекарственное средство не обладает таким разнообразием противовоспалительных свойств, по мнению многих авторов, противовоспалительные средства должны представлять смесь, состоящую из веществ, угнетающих отдельные звенья воспалительного процесса. Такой антивоспалительной смесью являются пептиды пчелиного яда – адолапин, мелиттин, МСД-пептид, протеазный ингибитор и апамин.

Гормональная активность компонентов пчелиного яда имеет преимущество, так как она осуществляется путем активирования самых верхних «этажей» гипофизарно-налпочечной системы. Давно известны неблагоприятные побочные последствия (особенно при лечении хронических заболеваний), вызванные применением глюкокортикоидных препаратов. Адренокортикотропный гормон (АКТГ), широко используемый как стимулятор коры надпочечников, при хронических и аллергических заболеваниях также снижает гтпофизарно-надпочечную активность. Существенное преимущество пептидных компонентов яда перед нестероидными противовоспалительными средствами состоит в том, что первые проявляют свое фармакологическое действие в очень малых дозах и их терапевтический индекс в десятки и даже сотни раз выше (Шкендеров, Иванов, 1985).

Пчелиный яд еще в глубокой древности с успехом применялся в народной медицине, и это послужило основанием включить его в современную экспериментальную и клиническую медицину. В далеком прошлом его употребляли как средство против боли, выпадения волос, лечения трудно заживающих ран и т.д. Сведения о лечебных свойствах пчелиного яда имеются в сочинениях древних естествоиспытателей и врачей Гиппократа, Плиния, Галена, описавших приготовление и применение лекарственных веществ растительного, минерального и животного происхождения.

В 19 веке лечение пчелиным ядом распространялось главным образом в Европе. Так, в 1864 г. петербургский профессор М.И. Лукомский описал лечение суставных болей, невралгий, болей в сердечной области методом пчелоужалений. С 1888 по 1912 г.г. в венских журналах был опубликован ряд статей чешского врача Ф. Терча о лечении пчелоужалением огромного числа пациентов, страдающих ревматизмом, невралгиями и другими недугами. Позднее пражский профессор Лангер опубликовал работы по лечению пчелиным ядом детского ревматизма, описал химические и фармакологические свойства яда и способ приготовления из него растворов для инъекций (Лудянский, 1991).

Отечественная апитоксинотерапия имеет богатую историю. Монография профессора Нижегородского государственного университета Н.М. Артемова «Пчелиный яд, его физиологические свойства и терапевтическое применение» была издана еще в 1941 году. Широкую известность получили классические исследования и практический опыт применения пчелоужалений врачами Э.М. Алескер, Г.П. Зайцевым, Э.А. Лудянским, Т.В. Виноградовой, Ф.Д. Карнеевым, А.Ф. Синяковым, М.П. Гусевой, В.Д. Макаровой и другими.


Каталог: books -> met files
books -> 5 зертханалық жұмыс Физикалық интерфейс. Желілік адаптерлер. Сабақтың мақсаты
met files -> Конфликты в тропической африке
met files -> Очерки теории и истории науки международного права
met files -> История и методология
met files -> Председатель методической комиссии биологического факультета ннгу, д п. н
met files -> В. А. Берендеев История политических учений Запада Учебно-методическое пособие
met files -> Е. В. Крылова С. В. Копылова анатомия человека спланхнология
met files -> Н. И. Лобачевского маркетинг в физической культуре и спорте учебно-методическое пособие
met files -> Тем индия накануне английского завоевания
met files -> А. К. Балдин Актуальные проблемы муниципального права России


Достарыңызбен бөлісу:
1   ...   16   17   18   19   20   21   22   23   ...   26


©kzref.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет