Н. И. Лобачевского получение рекомбинантных аденоассоциированных вирусов для трансдукции клеточных культур учебно-методическое пособие



жүктеу 361.88 Kb.
Дата13.09.2017
өлшемі361.88 Kb.
түріРуководство

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского


ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ТРАНСДУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР


Учебно-методическое пособие
Рекомендовано методической комиссией биологического факультета для студентов ННГУ, обучающихся по специальности 020207 «Биофизика»

Нижний Новгород

2013

УДК 591.1.085.23(075.8)



ББК Е991 я73

П49
П49 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТЫХ АДЕНО-АССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ТРАНСДУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. Составители: Митрошина Е.В., Ведунова Е.В., Симонов А.Ю., Бабаев А.А.: учебно-методическое пособие / Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2013. – 32 с.

Рецензент: д.б.н., проф. К.Н. Конторщикова
Методическое руководство содержит краткие теоретические сведения по методикам трансдукции про- и эукариотических клеток для получения генно-инженерных векторов.

Руководство предназначено для студентов 5 курса дневного отделения, обучающихся по направлению подготовки "Биология", по профилю "Биофизика" в рамках проведения практических работ по курсу "Нейрональные сети".

Ответственный за выпуск:

председатель методической комиссии биологического факультета ННГУ, д.п.н., профессор И.М. Швец

УДК 591.1.085.23(075.8)

ББК Е991 я73


© Нижегородский государственный

университет им. Н.И. Лобачевского, 2013

ВВЕДЕНИЕ

Генетическая инжене́рия (генная инженерия) – совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. На данный момент генная инженерия широко применяется в экспериментальной биологии, в частности для трансфекции и трансдукции эукариотических клеток, или организмов, а так же для трансформации прокариотических клеток.

Существуют различные методы внесения генетического материала в клетку. Вектор – это общее название «транспортного средства» для целенаправленной доставки того или иного гена. Векторы бывают либо синтетическими (основаны на полимерных материалах, например, липосомах), либо «натуральными», т.е. природного происхождения (например, плазмиды или векторы на основе различных вирусов). В зависимости от выбранного вектора ген может быть интегрирован в геном клетки-мишени, локализован в ядре в качестве искусственной мини-хромосомы или, как эписомальный элемент, находиться в ядре или цитоплазме. Трансфекция – процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки животных невирусным методом. Аналогичный процесс в бактериальных клетках называется трансформацией. Трансдукция – перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью вируса [Широкова, Ведунова, 2013].

Для введения нуклеиновых кислот в клетки хозяина применяются рекомбинантные ДНК. Технология создания рекомбинантных ДНК – одно из важнейших достижений молекулярной биологии 20 века. Рекомбинантные ДНК получают in vitro, создавая новые комбинации неродственных генов. Затем эти новые гены можно с помощью вектора ввести в подходящие клетки и размножить (клонировать) с помощью механизмов синтеза ДНК клетки-хозяина.

Выбор вирусов в качестве векторов обусловлен их естественной способностью специфически связываться с клеткой и проникать в нее. Возможность генно-инженерных конструкций на основе вирусных векторов проникать в клетки-мишени определяется белками оболочки вируса, взаимодействующими с рецепторными структурами, экспрессированными на поверхности клетки-мишени. Создаются векторные системы на основе аденовирусов, аденоассоциативного вируса, вируса простого герпеса, ретровирусов и лентивирусов. Также существуют системы векторов на основе папилломавирусов, вируса оспы крупного рогатого скота.

Для проведения трансдукции используются вирусы, генетический материал которых способен встраиваться в хромосому заражаемой клетки. Поскольку использование полноценных вирусов привело бы к развитию инфекции и гибели клеток, в молекулярной биологии применяют неполноценные (рекомбинантные) вирусы. Для их из генома вируса чаще всего исключаются участки, отвечающие за фазы цикла, связанные с выходом вируса из клеток. Это позволяет сохранить инфицированные клетки живыми.




Аденоассоциированный вирусный вектор

Вирусные вектора, создаваемые на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, являются одной из наиболее безопасных и эффективных способов доставки генетической информации в эукариотические клетки.

Аденоассоциированный вирус (англ. Adeno-associated virus, AAV) — малый вирус, инфицирующий клетки человека и некоторых других приматов. ААВ относится к роду Dependovirus семейства Parvoviridae. Вирус имеет небольшие размеры (20 нм), не имеет липидной оболочки и не кодирует собственных ферментов репликации. Для прохождения полного репликативного цикла ему необходимо совместное заражение с аденовирусом.

Аденоассоциированный вирус способен инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и способен встраивать свой геном в геном хозяина по специфическим участкам (AAVS1) 19й хромосомы. Эти свойства обуславливают то, что ААВ часто применяется в качестве вирусного вектора (рис. 1).

Использование аденоассоциированного вируса имеет как преимущества, так и недостатки. Одним из основных преимуществ является то, что этот вирус не является патогенным, то есть не вызывает заболеваний у человека. Данная особенность дает ААВ преимущества по сравнению с ретровирусами, которые также часто применяются для создания векторов. Ретровирусы являются потенциально опасными как мутагены, так как они встраиваются в геном хозяина случайным образом, что может привести к возникновению раковых опухолей. Геном аденоассоциированного вируса обычно встраивается по специфическому сайту, а случайные встраивания происходят с ничтожно малой частотой. При создании векторов для генной терапии на основе аденоассоциированного вируса из ДНК вируса удаляют гены rep и cap. Нужный ген вместе с промотором встраивают между инвертированными концевыми повторами (inverted terminal repeats, ITR), в результате чего в ядре после синтеза ДНК-полимеразой второй цепочки ДНК образуются контактомеры. Векторы для генной терапии на основе аденоассоциированных вирусов образуют эписомальные конкатамеры в ядре клетки хозяина.

Рисунок 1. Жизненный цикл AAV. AAV размножается в клетках, коинфицированных аденовирусом. В отсутствие аденовируса AAV поддерживается в латентном состоянии, интегрировавшись с хромосомой-19 (AAVS1). Латентный AAV может стать репликационно-активным при условии суперинфицирования клетки аденовирусом (Супотинский М.В., 2011)


В неделящихся клетках данные конкатамеры остаются интактными, в делящихся клетках ДНК аденоассоциированного вируса теряется при делениях клетки, так как эписомальная ДНК не реплицируется при репликации ДНК клетки хозяина. Случайное встраивание ДНК аденоассоциированного вируса в геном хозяина происходит весьма редко. Аденоассоциированный вирус также обладает очень низкой иммунногенностью, по-видимому, ограниченной низкой эффективностью образования нейтрализующих антител, в то время как для последних четко не показана цитотоксичность. Описанные особенности, а также возможность заражать неделящиеся клетки, обуславливают преимущества аденоассоциированного вируса над аденовирусами для генной терапии.

Использование аденоассоциированного вируса имеет также и некоторые недостатки. Поскольку вирус имеет набольшие размеры, то ёмкость вирусного генома, доступная для встраивания терапевтических генов, составляет всего около 4800 пар нуклеотидов. Таким образом, данный вектор не подходит для клонирования крупных генов. Инвертированные концевые повторы двух геномов могут гибридизоваться и образовывать конкатемеры голова-хвост, практически удваивая ёмкость вектора.

Описано более 10 различных серотипов ААВ. Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе ААВ создают, используя необходимый серотип. Серотип 2 подробно изучен, он обладает тропностью к скелетным мышцам, нейронам, гладким мышцам сосудов и гепатоцитам. AAV2 может проникать и в мозг и является строго специфичным к нейронам.

Одним из самых распространенных способов создания вируса для трансдукции является разделение вирусного генома на несколько значимых плазмид. Такой подход облегчает сборку вирусных конструктов и делает использование вирусных векторов более безопасным. Изначально геном вируса делится на три части или три независимые плазмиды. Две плазмиды кодируют белки, ответственные за упаковку, репликацию и проникновение (эти плазмиды называют вспомогательными, или хелперными); третья плазмида содержит генетическую информацию об интересующей нас структуре – эта плазмида называется информационной.

Далее проводится трансформация про- и эукариотических клеток. Трансформация процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т.д.

Каждая из плазмид способна проникать в клетку E.Сoli и реплицироваться там по принципу «катящегося» кольца. Генетической информации, содержащейся в каждой из этих плазмид, не достаточно для сборки полноценного вируса. Такие плазмиды могут быть внедрены в восприимчивые эукариотические клетки, например, НЕК-клетки (Human Embryonic Kidney). Если в одной НЕК-клетке встретятся все три плазмиды, то может собраться полноценный вирусный вектор. Количество вирусных векторов, имеющих полноценную вирусную оболочку, систему проникновения в восприимчивые клетки и репликации вирусных белков в одной НЕК-клетке, может достигать миллионов копий. Однако, такие вектора не способны выйти из клетки и реинфицировать окружающие клетки, так как гены, ответственные за данный процесс, чаще всего полностью элиминированы из вирусного генома.


ГЛАВА 1. ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

1.1. Получение (наработка) плазмидной ДНК

Плазмида – внехромосомный самовоспроизводящийся генетический элемент (фактор наследственности) бактерий и некоторых других организмов, в частности дрожжей. Все векторы для клонирования ДНК получены на основе плазмид либо вирусов.

Плазмида представляет собой кольцевую (очень редко – линейную) двухцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетке организма-хозяина. Векторная плазмида – переносчик ДНК.

Среди методов выделения плазмидной ДНК наиболее распространены разновидности метода щелочного лизиса трансформированных клеток бактерий, разработанного Бирнбоймом и Доли в 1979 году. Они позволяют легко отделить плазмидную ДНК от высокомолекулярной хромосомной ДНК. Трансформацию бактерий очищенной ДНК впервые осуществили Мандел и Хига. При инкубации ДНК фага лямбда λ с клетками E.coli в растворе CaCl2 при температуре 0С произошло проникновение ДНК фага внутрь бактериальных клеток, что в дальнейшем привело к размножению фаговых частиц и лизису клеток бактериальной культуры. То есть произошло то же самое, что и при инфекции природным фагом. Однако в норме «голую» ДНК бактериальные клетки поглощать не способны (кроме гемофильных и ряда грам-положительных бактерий).

Последующее развитие метода шло эмпирическим путем. Современная процедура включает получение так называемых «компетентных» клеток E.coli, способных воспринимать чужеродную ДНК, «тепловой шок», при котором ДНК проникает внутрь клетки, и отбор трансформированных клеток путём выращивания бактериальной культуры в селективных условиях.

В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы I и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. Для этого применяют среды с высоким содержанием ионов кальция, марганца, цезия, рубидия, электропорацию или заменяют клетки реципиента протопластами без клеточных стенок.

Плазмиды при проведении трансформации E.coli попадают только в очень небольшую часть (0,015%) клеток. Для отбора трансформированных клеток, несущих рекомбинантную ДНК, используют селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотику. Многие векторы содержат ген устойчивости к ампициллину bla. Он кодирует фермент β-лактамазу, который разрушает лактамное кольцо ампициллина. После осуществления процедуры трансформации бактерии высеивают на питательный агар, содержащий ампициллин. При этом выживают и образуют колонии только те клетки, в которые попала плазмида и синтезируется активная β-лактамаза. Эти клоны E.coli называют трансформантами. Другие векторы несут гены устойчивости к канамицину, тетрациклину.

Таким образом, получившие рекомбинантную плазмиду, т.е. трансформированные или изменённые по сравнению с исходными клетки приобретают способность размножаться на питательных средах, содержащих антибиотики. В то время как на остальные клетки бактериальной культуры антибиотики оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие.



Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК существенно ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Оптимальный pH для прохождения процесса — около 7.


Лабораторная работа № 1


Подготовка культур бактерий E. coli клеток для получения плазмидной ДНК
Материалы и оборудование

Штамм E.coli, находящийся в заморозке

Инкубатор для бактериальных клеток с функцией перемешивания

Спиртовки

Стеклянные колбы объемом 500 мл

Пробирки на 15 мл


Среды для культивирования бактерий можно готовить самостоятельно, либо использовать промышленные. Основные используемые среды следующие:
Среда 2YT (1000 мл)

  1. 900 мл дистиллированной воды

  2. 16г бакто-триптона.

  3. 10г дрожжевого экстракта.

  4. 5г NaCl.

  5. Довести pH до 7.0 NaOH (5Н).

  6. Довести объем среды до 1л дистиллированной водой.

  7. Проавтоклавировать (3,5 бар, 20 минут)


Среда SOB (1000 мл)

  1. 900 мл дистиллированной воды

  2. 20г бакто-триптона.

  3. 5г дрожжевого экстракта.

  4. 0,5 г NaCl.

  5. 0,186 г MgCl2

  6. 1,2 г MgSO4

  7. Довести pH до 7.0 NaOH (5Н).

  8. Довести объем среды до 1л дистиллированной водой.

  9. Проавтоклавировать (3,5 бар, 20 минут)


LB среда (1000 мл):

  1. 950 мл дистиллированной воды

  2. 10г бакто-триптона.

  3. 5г дрожжевого экстракта.

  4. 5г NaCl.

  5. Довести pH до 7.0 NaOH (1Н).

  6. Довести объем среды до 1л дистиллированной водой.

  7. Проавтоклавировать (3,5 бар, 20 минут)


LB среда с агаром:

    1. Приготовить среду LB, как указано выше, добавив 15 г/л агар-агара перед автоклавированием.

    2. После автоклавирования остудить среду до 55-60°C, добавить антибиотик, если это требуется и разлить по чашкам Петри.

    3. Дать застыть, хранить при +4°C в темноте, перевернув чашки вверх дном.


Получение миникультуры бактерий:

Поместить замороженный сток бактерий в пробирку с 10 мл среды LB (или среды 2YT), инкубировать сутки при 37oC при интенсивном перемешивании - 200 об/мин (можно сделать 3-4 миникультуры по 3 мл). Когда количество бактерий достигнет нужного значения, среда станет заметно мутной.


Получение максикультуры бактерий:

Взять 2,5-10 мл миникультуры и перелить их, соблюдая условия стерильности, в 250мл среды SOB, инкубировать при 37oC при интенсивном перемешивании около 3-6 часов (либо при 22-30oC - тогда время инкубации составит 24-48 часов).

В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста. В фазе логарифмического роста бактерии очень быстро делятся и не успевают создать полноценную клеточную оболочку. Именно в этом состоянии они наиболее восприимчивы и готовы в условиях температурного стресса к захвату чужеродной ДНК.

Для того, чтобы определить, что бактериальная культура находиться в логарифмической фазе роста, определяют оптическую плотность среды с культурой бактерий по сравнению с оптической плотностью стерильной среды при 600 нм. Считается, что нужная стадия роста достигнута, когда оптическая плотность составляет 0.3600<0.6.




Лабораторная работа №2


Перевод клеток E. coli в компетентное состояние
Материалы и оборудование:

Максикультура бактерий E.coli

Диметилсульфоксид (ДМСО)

TB буфер (100 мл)

10mM PIPES (0.3 g)

55mM MnCl2*2H20 (0.9 g)

15mM CaCl2*2H2O (0.22 g)

250mM KCl (1.9 g)

Довести pH до 6.7 5N KOH перед добавлением MnCl2

Профильтровать (через фильтр с диаметром пор 20нм)

Мелкий колотый лед.
Методика:

Все манипуляции при получении компетентных клеток необходимо проводить на льду. Все инструменты, пробирки, носики дозаторов и т.д. также должны быть холодными.


  1. После достижения максикультурой требуемой оптической плотности, необходимо поместить культуру на лед и охладить на льду не менее 10-15 минут. Перелить культуру в 50 мл центрифужные пробирки.

  2. Центрифугировать при 2500-3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4 ° С. Слить супернатант.

  3. Ресуспендировать клетки в 80 мл охлажденного буфера ТВ.

  4. Инкубировать на льду 10 мин

  5. Центрифугировать при 2500-3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4 ° С

  6. Аккуратно ресуспендировать клетки в 20 мл охлажденного ТВ буфера

  7. Добавить ДМСО до конечной концентрации 7% (1,5 мл)

  8. Инкубировать клетки на льду в течение 10 мин

  9. Подготовить пробирки 1,5 мл (эппендорфы) на охлажденном на льду штативе и аликвотировать в них компетентные клеток по 200 мкл

  10. Заморозить компетентные бактериальные клетки при температуре -80 °С


Лабораторная работа №3


Трансформация бактериальных клеток
Материалы и оборудование:

Аликвота компетентных клеток E. Coli

Плазмидная ДНК для проведения трансформации

Чашки Петри с LB средой с агаром и ампициллином

Жидкая LB среда без ампициллина и с ампициллином

Мелкий колотый лед

Водяная баня 42о C

Термошейкер для пробирок на 1,5 мл
Выполнение работы

• Пробирку с замороженной культурой компетентных бактериальных клеток поместить на лед. Они будут таять приблизительно 15-20 минут, периодически эппендорф необходимо встряхивать.

• 200 мкл аликвоты делят на 3-4 равных части

• Добавить плазмидную ДНК в эппендорф с E.coli в соотношении объемы ДНК к объему клеток 1:10. Смешать ДНК и бактериальные клетки

• Инкубировать клетки на льду не менее 20 минут.

• Создать бактериям тепловой шок на водяной бане в течение 45 сек при 42oC - в этот момент ДНК проникает через клеточную оболочку

• Поместить бактерии на лед на 3 минуты.

• Добавьте в эппендорф с трансформированными клетками трехкратный (или более) объем LB ( или 2YT ) среды без ампициллина и инкубировать при 37 °С при встряхивании (200-300 оборотов в минуту) на термошейкере по крайней мере 30 минут.

• Посеять бактериальные клетки на 10 см чашки Петри с LB средой с агаром, содержащей ампициллин (100 нг / мл).

• Инкубировать чашки в течение 12-16 часов при 37оС. Нельзя допускать перерастания бактерий и появления дочерних бактериальных колоний, поскольку клетки в дочерних колониях не будут содержать плазмиды.


1.2. Выделение плазмидной ДНК

Лабораторная работа №4


Получение бактериального максипрепарата для выделения ДНК
Для выделения плазмидной ДНК необходимо создать максипрепарат из трансформированных бактерий, содержащих интересующую нас плазмиду.
Материалы и оборудование:

Стелянные колбы объемом 500 мл

Пробирки центрифужные 15 мл

Спиртовка

Микробиологическая петля

Среда LB с ампициллином (см. выше)


Ход работы:

1. Сначала подготавливают миникультуру. Чтобы вырастить одну миникультуру стерильной микробиологической петлей (или зубочисткой) снимают одну колонию из вырасших на чашке Петри после трансформации и переносят ее в пробирку с 3 мл LB (или 2YT) среды с ампициллином (100 нг/мл), соблюдая условия стерильности. Миникультура помещается в термошейкер не менее чем на 6 часов (37°С, 200 оборотов в минуту). Когда численность бактерий в культуре станет достаточной, бактериальная среда станет заметно мутной.

2. Над пламенем спиртовки весь объем миникультуры переносится в стеклянную колбу, содержащую 200 мл LB (или 2YT) среды с ампициллином (100 нг/мл). В колбе должно быть достаточно воздуха, объем колбы должен быть не менее 500 мл. Максикультуры инкубируют 16-24 часа в термошейкере при температуре 37 °C, 200 оборотов в минуту.

3. Для выделения плазмидной ДНК максипрепарат над пламенем спиртовки переносят в 50-мл центрифужные пробирки и центрифугируют (4000 оборотов в минуту, 15 мин), супернатант сливают. Осадок для выделения ДНК можно заморозить при -20оС и провести выделение ДНК позже.




Лабораторная работа № 5


Метод выделелия плазмидной ДНК
Выделение ДНК проводят методом щелочного лизиса бактерий (метод Бирбойма и Доли). Наиболее удобным является использование готовых наборов реагентов с колонками для выделения ДНК, например NucleoBond. После применения калибровочного буфера, лизат бактериальных клеток под действием силы тяжести проходит через вложенный в колонку фильтр и ионообменную смолу (рис. 2).

Рисунок 2. Внешний вид колонок для выделения плазмидной ДНК (по материалам сайта Macherey-Nagel)


NucleoBond представляет собой ионообменную смолу, разработанную для выделения различных классов нуклеиновых кислот (олигонуклеотидов, РНК, плазмид). Ионообменная кремниевая смола состоит из гидрофильных, крупнопористых шариков, содержащих функциональную группировку МАЭ (метил-амино-этанол), которая при кислых значениях рН высокоспецифично связывается с остатками фосфорной кислоты ДНК. После промывки фильтра от прочих молекул (протеины, углеводы и т.д.) ДНК элюируется, осаждается и затем растворяется в любом подходящем буферном растворе.
Материалы и оборудование:

Центрифужные пробирки 15 и 50 мл

Штатив

Поддон для слива реагентов



Центрифуга с функцией охлаждения

Набор NucleoBond Xtra Midi

Изопропанол

70% этанол

10 мМ трис-хлор, рН 7,5
Методика работы:

Все шаги приводятся для использования набора для выделения ДНК NucleoBond Xtra Midi

1. Осадок, полученный после центрифугирования максикультуры трансформированных бактерий, ресуспензируют в буфере, содержащем фермент рибонуклеазу А (RNaseA) (добавляется в буфер Res непосредственно перед использованием) путем интенсивного пипетирования клеток в буфере (8 мл).

2. К суспензии клеток добавить 8 мл лизирующего буфера Lys. Буфер может содержать белый осадок, в этом случае его необходимо подогреть до 30-40 оС, пока осадок не растворится, и затем остудить до комнатной температуры. Перемешать клеточную суспензию и буфер пятикратным переворачиванием пробирки. Не взбалтывать. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.

3. Установить колонку из набора в штатив, помещенный в поддон для слива растворов. На край вложенного фильтра по кругу нанести 12 мл калибровочного буфера EQU. Подождать, пока весь буфер профильтруется через колонку.

4. К клеточной суспензии добавить 8 мл нейтрализующего буфера NEU, перемешать переворачиванием пробирки 10-15 раз. Суспензия должна стать гомогенной.

5. Центрифугировать суспензию 30 минут при 4500-5000 об/мин для осаждения крупных осколков клеток.

6. Супернатант пропустить через колонку (рис. 3).

7. Промыть фильтр в колонке 5 мл калибровочного буфера EQU.

8. Удалить фильтр из колонки. Колонку, содержащую только ионообменную смолу, снова установить в штатив и промыть 8 мл промывочного буфера Wash.

9. Установить колонку на пробирку и провести элюирование ДНК с помощью 5 мл буфера Elu, элюат собирается в 15 мл центрифужную пробирку.

Рисунок 3. Схема выделения плазмидной ДНК с помощью наборов NucleoBond (по материалам сайта Macherey-Nagel)


10. для преципитации ДНК добавить 3,5 мл изопропанола. Тщательно перемешать.

11. центрифугировать при 4500-5000 об/мин 30 минут при 4оС. Полностью удалить супернатант.

12. Для промывки ДНК добавить 2 мл 70% этанол, центрифугировать при скорости 11 000 обор/мин 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно удалить этанол из пробирки, осадок высушить при комнатной температуре.

13. Высушенную и очищенную плазмидную ДНК растворить в 500 мкл 10 мМ трис-хлор, pH 7,5


Контрольные вопросы:

1. Что означает термин "компетентные клетки"?

2. Как определяют, эффективно ли прошла трансформация бактериальной клетки?

3. На чем основан принцип используемого в работе метода выделения плазмидной ДНК?


ГЛАВА 2. Подготовка культур клеточных линий позвоночных для трасфекции

Для трансфекции используют эукариотические клетки различных непрерывных линий позвоночных, наиболее часто используют клеточные линии НЕК 293Т (human embryonic kidney), НЕК 293TF и М-Неla.

Постоянная (непрерывная) клеточная линия — это клетки, способные субкультивироваться вне организма в течение неограниченного количества пассажей. Только на основе опыта с фибробластоподобными клетками человека показано, что культура должна субкультивироваться, по крайней мере, 70 раз с интервалом примерно в три дня, прежде чем ее можно будет считать постоянной (непрерывной) линией клеток. Все культуры с неограниченной способностью к размножению («бессмертные культуры») следует называть постоянными (непрерывными) или стабильными линиями. В вирусологической литературе широко распространен термин «перевиваемые линии клеток», под которым имеются в виду линии клеток, способные к бесконечному росту вне организма. При создании постоянных клеточных линий используют генетическую трансформацию клеток, полученных от человека или животного (первичные клеточные линии). Под трансформацией клеток подразумевают необратимые генетические изменения, характеризующиеся изменением ростовых свойств культивируемых клеток. Трансформация делает клетки бессмертными и менее зависимыми от питательных факторов и геометрических параметров роста. Изменение ростовых свойств связано с изменением транспортировки питательных веществ через клеточную мембрану и является одной из адаптивных особенностей, позволяющих клеткам размножаться в условиях, неблагоприятных для не трансформированных родительских клеток. Изменение клеточной мембраны сопровождается потерей поверхностного белка (150 кД) и изменением антигенных свойств. Основное достоинство трансформированных клеток   способность к бесконечному размножению и улучшенные ростовые свойства. Трансформированные клетки могут образовывать опухоли у иммунологически толерантных животных. По этой причине трансформацию иногда неправомерно приравнивают к злокачественным изменениям. Первичные культуры клеток, линии диплоидных и трансформированных клеток получили широкое применение в вирусологической практике и явились основой создания крупномасштабных систем культивирования клеток и производства вакцин.

Получение постоянных линий намного расширило исследования в области клеточной биологии и вирусологии. На их основе появилась возможность получения мутантных и гибридных линий клеток, что открыло перспективу создания новых субстратов, пригодных для культивирования вирусов. Способность к неопределенно длительному размножению в культуре, как правило, связана с анеуплоидным кариотипом. Некоторые линии клеток (например, фибробластов хомячка — ВНК-21) хотя и обладают правильным диплоидным числом хромосом, но их кариотип, по-видимому, изменен. Другие критерии трансформации (онкогенность, контактное торможение требования к среде) проявляются у различных линий неодинаково. Все они получены в результате спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие происходят из опухолей животных, хотя не всегда при эксплантации опухолевых клеток in vitro образуются клеточные линии. Линии клеток, полученные непосредственно из опухолевых тканей (т.е. трансформированных в организме), часто сохраняют специализированные функции, например, способность продуцировать некоторые ферменты в течение более продолжительного периода, чем клетки, трансформированные в культуре различными методами (физическими, химическими, вирусными агентами).

Подготовительным этапом перед проведением трансфекции является культивирование клеток для наращивания необходимой клеточной массы.

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных.




Лабораторная работа №6


Культивирование клеточной линии эмбриональной почки человека трансформированной НЕК 293Т
Для проведения трансфекции необходимы культуры HEK293T или HEK293FT клеток с площадью покрытия поверхности 70-80% (приблизительно 5*106 клеток на один T175-флакон должно быть на день перед трансфекцией).

Постоянная клеточная культура НЕК 293Т как и все охарактеризованные перевиваемые линии имеют паспорт культуры, в котором отражены основные характеристики и условия культивирования.

Паспорт клеточной линии НЕК 293Т

Происхождение: человек, почка эмбриона, клетки, трансформированные ДНК аденовируса типа 5 (Ad 5). Gen. Virology 1977. 36:59; Virology 1977. 77: 319; Атлас хромосом постоянных линий человека и животных, С.Е. Мамаева, 2002. М. Научный мир.

Морфология: эпителиоподобная

Способ культивирования: монослойный

Условия культивирования: среда - ЕМЕМ или DMEM

Сыворотка: эмбриональная бычья (или по АТСС инактивированная лошадиная) -10%

Другие компоненты: NEAA 1% (EMEM)

Процедура пересева - снятие клеток, используя трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:2-1:3), кратность рассева 1:2 - 1:3 , оптимальная плотность 3.0-5.0х104 кл/см2, клетки прикрепляются к субстрату в течение нескольких дней.

Криоконсервация - ростовая среда, 10% DMSO, 1.0х106 клеток/мл в ампуле

Жизнеспособность после криоконсервации: 90-95% (окраска трипановым синим на нулевом пассаже)

Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены

Контроль видовой идентичности: кариологический анализ

Кариология: 2n=46, модальное число хромосом 72, количество маркеров   12

(дифференциальная окраска), количество полиплоидов – 2.4%.

Другие характеристики:

чувствительность к вирусам: аденовирусы человека и астровирусы

присутствие и экспрессия трансформирующих генов Ad 5.

Область применения: биотехнология (титрование аденовирусов человека), вирусология, трансформация.

Коллекции: ATCC CRL 1573; ECACC 85120602; ИНЦ РАН.

При культивировании данная клеточная линия образует монослой на дне культурального планшета. Для проведения процедуры пересева необходимо:

1. Перенести культуральную среду из матраса в одноразовую центрифужную пробирку с крышкой.

2. Промыть культуральный монослой PBS 2 раза

3. Промыть культуральный монослой смесью версен-трипсин

4. Залить смесь версен-трипсин в культуральный матраса (5 или 15 мл в зависимости от объема используемого культурального матраса). Поместить культуральный планшет в СО2-инкубатор для снятия монослоя. Клетки линии НЕК 293Т теряют свою адгезивную способность в безкальциевой среде, поэтому для этой клеточной линии не обязательно проводить процедуру снятия клеточного монослоя с помощью смеси версен-трипсин. Монослой можно просто смыть раствором полифосфатного буфера, однако в этом случае затрудняется подсчет количества клеток в камере Горяева, поскольку без использования ферментов клетки не полностью диссоциируются и остаются в виде небольших конгломератов.

5. Через 5-7 минут, когда клетки полностью отстали от дна матраса, раствор версен-трипсина с плавающими в нем клетками переносят в ту же пробирку, куда была перенесена культуральная среда.

6. Планшет тщательно промывают раствором PBS, для того, чтобы смыть со стенок остатки клеток.

7. Культуральную среду с раствором версен-трипсина, содержащего клетки откручивают 3 мин 1000 оборотов/мин.

8. После центрифугирования образуется осадок, состоящий из клеток. Надосадочную жидкость полностью удаляют.

9. Осадок растворяют в 2 мл клеточной среды (ДМЕМ, содержащая 10 % телячьей эмбриональной сывороткой).

10. Осадок ресуспензируют и рассеивают 1 к 3 относительно исходной плотности на культуральные матрасы.

Через 1-2 часа можно оценить количество клеток, прикрепившихся ко дну культурального матраса. Морфологическое исследование позволяет обнаружить делящиеся клетки культуры.

Обязательными процедурами при культивировании постоянной клеточной линии являются: криоконсервация и выведение из криоконсервации. Постоянные клеточные линии являются по сути бессмертными, клети линии способны к неограниченному делению, в связи с этим уход за ними связан необходимостью постоянного пересева и смены среды. Однако, клеточные линии могут быть введены в криоконсервацию и храниться в условиях экстремально низких температур много лет. Обязательным условием содержания клеточных линий при криоконсервации является температура менее -135 С. Считается, что именно при этих условиях тепловое движение молекул не значительно, что обеспечивает возможность долговременного хранения.




Лабораторная работа №7.


Криоконсервация
Для криоконсевации необходим специфический комплекс, обеспечивающий сохранность клеток при заморозке и разморозке. Известно, что вода, находящаяся в клетках, при переходе в твердое состояние расширяется и разрывает клеточные мембраны. Применение фриз-реагентов помогает сохранить жизнеспособность 80-97% клеток при заморозке-разморозке. В качестве фриз реагентов традиционно используют глицерин или диметилсульфоксид (ДМСО).

Перед криоконсервацией готовят двукратный фриз. Двукратным он является потому, что при добавлении в него равного объема среды содержащей клетки концентрация основных реагентов уменьшается в 2 раза.


Двукратный фриз:

Эмбриональная телячья сыворотка – 40%

Среда ДМЕМ – 40%

ДМСО – 20%

Стерилизацию фриза осуществляют с помощью фильтрующих насадок на шприц с диаметром пор 20 мкм.

После снятия клеток с культурального матраса (см. выше) и осажденную клеточную массу ресуспензируют в 1 мл бессывороточной среды ДМЕМ. Проводят подсчет количества клеток в камере Горяева. Суспензию клеток разводят из расчета 3-4 млн. клеток на мл бессывороточной средой.

К полученной суспензии добавляют равное по объему количество двукратного фриза. Теперь концентрация ДМСО и сыворотки составляет 10% и 20% соответственно, а количество клеток 1,5-2 млн. на мл.

Клеточную суспензию с фризом разливают, предварительно подписанным, по пробиркам для криоконсервации и помещают в условия -20С. Примерно через 20 минут, когда суспензия клеток полностью замерзнет, пробирки переносят в условия – 135С (или ниже) где они могут храниться до нескольких лет.

Для идентификации криопробирок и, соответсвенно, клеточных культур. Необходимо правильно маркировать криопробирки, указывая всю необходимую информацию. Нельзя маркировать пробирки с помощью стикеров. Данный вид маркировки не подходит для хранении при низких температурах.

Маркировка криопробикрок:

Полное название клеточной линии

Фамилия сотрудника, поводившего процедуру криоконсервации

Дата криоконсервации

Выведение из клеточной линии из криоконсервации

Перед выведением клеточной линии из криоконсервации необходимо приготовить культуральную среду, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Среда с высоким содержанием сыворотки (20%) применяется для инактивации ДМСО в фриз-реагенте и для активации роста клеток после выхода из криоконсервации. Ростовая среда предварительно прогревается до 37С на водяной бане или в условиях инкубатора.

После извлечения из криохранилища, пробирку с клеточной линией помещают в стаканчик с теплой водой (36-38С). В таких условиях происходит быстрое размораживание клеточной массы.

После того как лед в криопробирке полностью растает, пробирку быстро обтирают спиртом, горлышко пробирки обжигают с помощью спиртовки. Пробирка открывается и все содержимое пробирки переноситься в стерильную центрифужную пробирку с крышкой, содержащую 12 мл прогретой среды ДМЕМ с 20% сыворотки. Таким образом, фриз разбавляется в 12 раз и концентрация токсичного для клеток реагента (ДМСО) снижается.

Пробирку с ростовой средой откручивают при скорости 800 оборотов в минуту, в течение 3 минут. Щадящие условия центрифугирования необходимы для того, чтобы не разрушить клетки после криконсервации.

После центрифугирования образуется осадок, содержащий клетки. Всю надосадочную жидкость полностью удаляют. Осадок ресуспензируют в 1 мл культуральной среды.

50 мкл раствора, содержащего клетки отбирают в отдельную пробирку. Объём доводят РВS до 1 мл. К полученной суспензии добавляют 0,3% раствор трипанового синего и проводят подсчет общего количества клеток и количества живых клеток в камере Горяева.

Культуральную среду с ресуспензированными в ней клетками переносят в лунку 6-ти луночный планшет, объем доводят до 2 мл ДМЕМ с 20% сыворотки и оставляют на 6 часов для прикрепления клеток ко дну планшета. Через 6 часов оценивают плотность клеток прикрепившихся ко дну лунки. Если плотность максимальна, всю среду переносят в соседнюю лунку, а клеточный монослой заливают свежей средой, содержащей 20% сыворотки.

Через 48 часов проводят процедуру пересева клеточной линии на культуральный матрас. При этом линию переводят на среду, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Контрольные вопросы:

Что такое постоянные клеточные линии?

Чем отличаются постоянные клеточные линии от первичных?

Что означает термин «культивирование клеток»?


ГЛАВА 3. Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов

Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений.

При смешивании растворов линейных поликатионов и ДНК формируются интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) за счет образования кооперативной системы межцепных электростатических связей. При этом поликатионные цепи окружают молекулу ДНК, образуя сферы или тороиды, в зависимости от типа полимера. Включение в ИПЭК приводит к компактизации ДНК, повышению ее устойчивости к действию нуклеаз, способствует усилению ее взаимодействия с клеточной мембраной и повышению трансформирующей активности по отношению как к прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. Соединяя молекулы поликатиона с лигандами, способными к специфическому связыванию с клеточной мембраной, можно обеспечить проникновение ИПЭК в клетку по рецепторному пути, а в организме – адресную доставку к клеткам-мишеням.


Лабораторная работа №8.


Трансфекция культур эукариотических клеток при помощи полиэтиленимина
Материалы.

Плазмиды: экспрессирующая плазмида (например, синапсин AAV-Syn-EGFP), хелперные плазмиды, кодирующие белки капсида (должны быть смешаны в эквимолярных количествах с экспрессирующей плазмидой)

Для трансдуцирования культур первичных нейронов оптимальной является смесь серотипов Helper1 pDP1 (provides the capsid serotype1) и Helper2 pDP2 (provides the capsid serotype2).
Реактивы:

ПЭИ (1 мг/мл) – линейный полиэтиленимин 25kD ( Polysciences (cat# 23966-2)).

Приготовление раствора ПЭИ:


  • Растворить ПЭИ (1 мг/мл) в эндотоксин-свободной дист. H2O, нагретой до ~80°C.

  • Остудить до комнатной температуры

  • Довести рН до 7,0, профильтровать(0.22um), аликвотировать и хранить при -20°C; рабочий раствор может хранится при 4°C.

Культуральная среда DMEM без добавок (для трансфекции)

Культуральная среда DMEM с L-глутамином, добавлением антибиотика (пенициллин-стрептомицин) и 10% телячьей эмбриональной сыворотки (для культивирования клеток и продукции вируса)

T-175 культуральные флаконы (2 шт. для получения одного вируса)


Выполнение работы

  • Смешать экспрессирующую и хелперные плазмиды, например, AAV-Syn-EGFP/pDP1/pDP2 плазмиды (20, 35, 35 мкг ) с 1.5 ml культуральной среды DMEM без сыворотки

  • Смешать 270 мкл ПЭИ и 1,5 мл DMEM (без сыворотки, соотношение ПЭИ/ДНК должно составлять 3:1)

  • Добавить смесь среды и ПЭИ к DNA, инкубировать минимум 15 минут при комнатной температуре

Данного количества смеси достаточно для проведения трансфекции на 2х культуральных флаконах Т175

  • Добавить культуральную среду DMEM (без сыворотки) к смеси PEI/DNA, доведя объем до 15 мл.

  • Произвести замену культуральной среды HEK293T на смесь PEI/DNA/DMEM (7,5 мл на флакон)

  • Инкубировать 4-5 часов при 37 С, 5% CO2, добавляя по 5 мл среды

  • Дважды отмыть клетки от смеси ДНК/ПЭИ средой с сывороткой

  • Заменить среду на обычную – DMEM с 10% сыворотки и добавлением пенициллина/стрептомицина

  • Инкубировать 48-72 часа в инкубаторе 37 С, 5% CO2

Поскольку ПЭИ является токсичным, часть клеток может погибнуть во время инкубации (до 20%). Если плотность культуры чрезмерно высока и в течение 48 часов возможно перерастание, содержание сыворотки в культуральной среде возможно снизить до 2%, что замедлит деление клеток.


Лабораторная работа № 9.


Выделение вирусных частиц

Материалы и оборудование:

Культуры НЕК293Т, трансфецированные рекомбинантной ДНК (2 флакона Т175).

Фильтры FP30/0,45 мкм (0,22 мкм также могут быть использованы)

Лизирующий буфер (50mM TrisCl ph8, 0, 150 mM NaCl, профильтровать)

Benzonase® Nuclease (Sigma, cat #: E1014)

Бензоназный буфер 10x (500 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA – бычий сывороточный альбумин, профильтровать)

Фосфатный буферный раствор (PBS) без Ca и Mg.


  • Клетки HEK аккуратно дважды промыть PBS

  • Добавить 10-15 мл PBS, инкубировать 5 минут при 37С. Поскольку в растворе не содержится ионов Са2+, клетки теряют способность к адгезии и открепляются от пластика. Поливая дно культурального флакона струей PBS из дозатора, полностью перевести все клетки в суспензию

  • Собрать PBS с клетками в 50 мл центрифужные пробирки и отцентрифугировать при 1000 об/мин в течение 5 мин.

  • Удалить супернатант

  • Клетки растворить в 2 мл лизирующего буфера

  • Трехкратно подвергнуть лизат клеток замораживанию/оттаиванию, каждый раз перемешивая. Для заморозки можно использовать жидкий азот, 70% этанол в сухом льду или морозильную камеру (-70С)

  • После последнего размораживания отцентрифугировать лизат клеток при 2000 об/мин в течение 5 min.

  • Ферментативная обработка бензоназой: добавить к лизату клеток такое количество концентрированного (х10) бензоназного буфера, чтобы получить требуемую итоговуб концетрацию (х1) и не менее 250 единиц Бензоназы на 1 препарат, икубировать 30 минут при 37oC. Бензоназа уделяет нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, которые не защищены вирусным капсидом. Данная процедура необходима для того, чтобы в препарате осталась только вирусная ДНК. Неочищенные вирусные препараты могут быть токсичны для первичных нейрональных культур.




  • Центрифугировать при 2000-2500 об/мин 5 мин для осаждения различных белковых гранул и обломков крупных молекул.

  • Профильтровать супернатант через 0.45 M фильтр, фильтрат собрать в эппендорф.

  • Либо дополнительно очистить и сконцентрировать полученный вирус, либо разликвотировать непосредственно фильтрат. В случае если все процедуры выполнены правильно, то число вирусных копий достигает 107-108 вирусных геномов на микролитр.


Лабораторная работа №10


Дополнительная очистка и концентрация вирусного препарата:
Данная методика может использоваться для дополнительной очистки, концентрации или смены буфера, в котором находится вирус, например, на PBS. Колонки Amicon Ultra обычно применяются для концентрации белков, можно использовать их и для концентрации вирусов.

Материалы и оборудование:

Колонки для концетрирования белка Amicon Ultra-15 (рабочий объем 15ml, мембрана: Ultracel-10K, Millipore, cat #: UFC901024).

Вирусный препарат

Фосфатный буферный раствор или трис-Cl.


  • Увеличить объём вирусного препарата, доведя его до 15 мл требуемым буфером.

  • Загрузить препарат в колонку Amicon Ultra

  • Центрифугировать при 1500-2000 об/мин 5-20 мин пока не будет достигнут требуемый объем (около 1 мл, слишком концентрированный вирус может образовывать агрегаты, что нежелательно)

  • Вирус останется в верхней части колонки. Можно еще раз увеличить объем буфера и снова отцентрифугировать, либо сразу разликвотировать вирусный препарат по 50 мкл

  • Вирусные препараты хранятся при -80С. Рабочая аликвота может хранится при +4 С.

Для инфецирования нейронов необходимо как минимум 1000-2000 копий вирусного генома на одну клетку. Данный параметр называется Multiplicity of Infection (MOI   множественность инфекции). Однако, "рабочего" количества вируса в препарате должно быть достаточно для инфецирования сотен тысяч нейронов. Обычно используется 1 мкл препарата (107 вирусных геномов) для ифецирования культуры нейронов.
Контрольные вопросы:

1. Какие плазмиды необходимо применять для трансфекции эукариотических клеток, чтобы получить векторные вирусные частицы?

2. Для чего применяется полиэтиленимин?

3. Что такое "множественность инфекции"?


Рекомендованная литература:

1. Daya S., Berns K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors // Clin. Microbiol. Rev. - 2008. - V. 21 (4). - P. 583-593.

2. Inder M. V., Nikunj S. Gene therapy promises, problems and prospects // Nature. - 997. - Vol. 389. - P. 239-242.

3. Miller D. G., Trobridge G. D., Petek L. M. Large-scale analysis of adenossociated virus vector integration sites in normal human cells // J. Virol. -2005. - Vol. 79 (17). - P. 11434 - 11442.

4. Nakai H., Storm T. A., KayM. A. Recruitment of single-stranded recombinant adeno-associated virus vector genomes and intermolecular recombination are responsible for stable transduction of liver in vivo // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - P. 9451 - 9463.

5. Russell D. W., Hirata R. K. Human gene targeting by viral vectors // Nat. Genet. - 1998. - Vol. 18. - P. 325 - 330.

6. Методы генетической трансформации. Сост. Широкова О.М., Ведунова М.В.: учебно-методическое пособие.- Нижний Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2013. – 30 с.

7. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство: Учеб. пособие – Саратов: Издательство «Саратовский источник», 2013. – 84 с.

8. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб.-справ. пособие. - Новосибирск.: Наука, 2004. - 496 с.

9. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.:Мир, 2002. – 582 с.

10. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. - М.: Мир, 1998. Т. 1-2.

11. Саложкин С.В., Большаков А.П. Трансфекция клеток нервной системы // Журнал высшей нервной деятельности. – 2009. – Т.8. – С. 631-641.

12. Grieger J.C., Samulski R.J. Adeno-associated virus as a gene therapy vector: vector development, production and clinical applications // Advances in biochem. engine./biotechnol. – 2005.- V. 99. – P. 119-145.

13. Ponnazhagan S., Mukherjee P., Yoder M.C. et al. Adeno-associated virus 2-mediated gene transfer in vivo: organ-tropism and expression of transduced sequences in mice // Gene/ - 2005/ - V.29. – P. 203-210.

14. Carter B.J. Adeno-Associated Virus Vectors in Clinical Trials // Human Gene Therapy. -2005. – V.16(5). – P. 541-50.

15. Генотерапевтические векторные системы на основе вирусов // Биопрепараты. - 2011. - № 3. - С. 15-26.

16. Macherey-Nagel [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.mn-net.com/tabid/1368/default.aspx

Приложения

Приложение 1. Карта экспрессирующей плазмиды (разработана Pavel Osten, лаборатория Peter Seeburg, Хадельберг)


Basis Construct:

A4-AAV-Syn(0.5)-EGFP




Приложение 2. Карта хелперной плазмиды pDP1 AAV helper plasmid (Jurgen Kleinschmidt DKFZ)




Оглавление


Введение…………………………………………………………………….. 3

Глава 1. Трансформация прокариотических клеток………………… ……7


1.1. Получение (наработка) плазмидной ДНК………………………. 7

1.2. Выделение плазмидной ДНК ………………………................... 12


Глава 2. Подготовка культур клеточных линий позвоночных для трансфекции ……………………………………………………………..… 17

Глава 3. Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов………………………………………23

Рекомендованная литература ……………………………………………….27

Приложения………………………………………………………………...…29



ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТЫХ АДЕНО-АССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ТРАНСДУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР


Составители:

Елена Владимировна Митрошина

Мария Валерьевна Ведунова

Александр Юрьевич Симонов

Алексей Александрович Бабаев
Учебно-методическое пособие
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского».


603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
Подписано в печать . Формат 60х84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Таймс.

Усл. печ. л. . Уч.-изд. л. .

Заказ № . Тираж 70 экз.


Отпечатано в типографии Нижегородского госуниверситета

им. Н.И. Лобачевского

603600, г. Нижний Новгород, ул. Большая Покровская, 37

Лицензия ПД № 18-0099 от 14.05.01






Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет