Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Красноярск сфу 2012



жүктеу 307 Kb.
Дата11.05.2019
өлшемі307 Kb.
түріУчебно-методическое пособие

Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

Большой практикум

Раздел «Свободнорадикальные процессы

в биологических системах»
Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе
Специальность 020208.65 - Биохимия

Красноярск

СФУ

2012

УДК 577.1(07)

ББК 28.072. я73

Составитель: Н.М.Титова

Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе /[Текст] / сост. Н.М. Титова, Т.Н. Субботина. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 20 с.

Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы по большому практикуму составлено в соответствии с программой. В учебном пособии представлены подробные, четко структурированные работы по разделу большого практикума «Свободнорадикальные процессы в биологических системах» разной степени сложности.

Пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов.

УДК 577.1(07)

ББК 28.072.я73

© Сибирский

федеральный

университет, 2012


Общие сведения
Большой практикум (СД.Р.6) – дисциплина, являющаяся федеральным компонентом Государственного образовательного стандарта подготовки специалистов в области биохимии (020208.65 – Биохимия).

Самостоятельная работа студентов вносит весомый вклад в подготовку специалистов-биохимиков, поскольку она способствует не только усвоению учебного материала, но и его расширению, формированию умения работать с различными видами информации, развитию аналитических способностей, навыков контроля и планирования учебного времени. Самостоятельная работа способствует развитию у студента таких необходимых навыков, как выбор и решение поставленной задачи, сбор и аналитический анализ опубликованных данных, умение выделять главное и делать обоснованное заключение.



Целью дисциплины является подготовка высококвалифицированных биохимиков, способных выполнять исследования, самостоятельно планировать ход работы и подбирать необходимые методы для решения конкретных задач.

В задачи данного раздела дисциплины входит ознакомление студентов с процессами свободнорадикального окисления биомолекул; основными методами получения и анализа экспериментальных данных; механизмами развития окислительного стресса и влияния различных компонентов антиоксидантной системы на окислительный гомеостаз.

В результате освоения дисциплины обучающиеся должны



знать:

• основные пути образования активных форм кислорода в биологических системах;

• свойства активных форм кислорода и методы их анализа;

• компоненты ферментативной и неферментативной антиоксидантной системы;

• терминологию, используемую в лабораторных исследованиях;

• механизмы пробоподготовки для проведения биохимического анализа;



уметь:

• правильно использовать биохимическую посуду и оборудование при проведении биохимического анализа;

• разработать план проведения эксперимента;

• определять уровень окислительных повреждений в липидах и белках;

• оценить антиоксидантные свойства нутриентов и понимать значимость результатов их биохимического анализа;

• использовать полученные экспериментальные навыки при изучении других биологических дисциплин; применять их в биохимическом мониторинге окружающей среды, в оценке нарушений метаболических процессов при патологических состояниях;



владеть навыками:

• делового общения;

• работы в команде;

• работы с компьютером на уровне пользователя, использования информационных технологий для решения фундаментальных и прикладных задач в области профессиональной деятельности;

• получения и интерпретации лабораторной биохимической информации;

• владеть методологическими основами современной науки.

Большой практикум – важный этап в изучении закономерностей и механизмов биохимических процессов в норме и при патологии. Проведение большого практикума базируется на знании органической химии, физической и коллоидной химии, биоорганической химии, ботаники, зоологии, биохимии, биофизики, физиологии человека и животных, энзимологии, кинетики и термодинамики ферментативных реакций, экологии и патологической физиологии. Особое внимание обращается на правильность выполнения биохимического анализа, на последние достижения наук в лабораторной диагностике нарушений биохимических процессов, а также на применение знаний о методах биохимических исследований в практической деятельности человека, и, прежде всего, в медицине.

В свою очередь данный курс оказывает влияние на получение фундаментальных знаний в различных областях биологии. Освоение данной дисциплины необходимо для дальнейшего изучения медицинской биохимии, вирусологии, биотехнологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной сигнализации, фармакологии.




  1. Трудоемкость дисциплины

Общая трудоемкость дисциплины приведена в табл.1.


Таблица 1 – Виды учебной работы и трудоемкость раздела большого практикума «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»


Вид учебной работы

Всего

(часов)


Семестр

7


Общая трудоемкость дисциплины

45

45

Аудиторные занятия:







лекции







лабораторные работы (ЛР)

40

40

промежуточный контроль







Самостоятельная работа:

5

5

изучение теоретического курса (ТО)

5

5

Вид итогового контроля (зачет, экзамен)




зачет

Организация самостоятельной работы производится в соответствии с графиком учебного процесса и самостоятельной работы (приложение).


2. СТРУКТУРА САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Трудозатраты на самостоятельную работу по разделу большого практикума «Свободнорадикальные процессы в биологических системах» приведены в табл. 1. Самостоятельная работа студентов включает изучение теоретического материала, работу с учебной, научной и справочной литературой.
3. МЕТОДИКА РЕАЛИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
Для самостоятельной работы студенты используют литературу и электронные ресурсы читальных залов библиотеки СФУ. Итогом самостоятельного изучение теоретического материала являются конспект, таблицы, схемы метаболических путей.

Конспект – это краткое, либо подробное и последовательное изложение информации, полученной из различных источников (лекция, проработанная литература, просмотренные презентации, видеодокументы и т. д.).

Таблица – это перечень сведений, цифровых данных, расположенных по графам в определенном порядке. Таблицы используются, когда необходимо показать информацию, логически упорядоченную в столбцы и ряды.

Темы для самостоятельного теоретического изучения раздела большого практикума «Свободнорадикальные процессы в биологических системах» приведены в табл. 2. вместе с перечнем примерных вопросов для самоконтроля и рекомендованными источниками информации. Самостоятельное изучение теоретического материала проводится параллельно с лабораторными занятиями. В соответствии с планом каждой занятия, студент обязан во время самостоятельной работы повторить теоретический материал по классификацию активных форм кислорода и азота, источникам активных форм кислорода и азота в биологических системах. Рассмотреть механизмы развития процессов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков, характеристику компонентов антиоксидантной системы. Выучить необходимые структурные и расчетные формулы, освоить принципы создания схем окислительного стресса, ознакомиться с основными методами биохимического анализа.


Таблица 2 – Темы для самостоятельной работы


№ п/п

п


Разделы

дисциплины



Темы для самостоятельной работы, трудоемкость (часы)

1

Свободнорадикальные процессы в биологических системах


1.1. Активные формы кислорода и азота – классификация, механизмы образования (2 ч.).

1.2. Окислительная модификация биомолекул активными формами кислорода (2 ч.).

1.3. Компоненты антиоксидантной системы и их характеристика (2 ч.).




Тема 1.1. Активные формы кислорода и азота – классификация, механизмы образования.

В живых системах имеются как система генерации активных форм кислорода (АФК), так и достаточно эффективные системы защиты от повреждающего воздействия таких форм на интактные клетки. В норме между этими системами существует равновесие, обеспечивающее нормальное функционирование субклеточных структур и органов в целом. При различных патологических состояниях происходит смещение этого равновесия в сторону некомпенсированной генерации АФК и формирование окислительного стресса. Являясь основными инициаторами свободнорадикального окисления кислородные радикалы, наряду с промежуточными и конечными продуктами окисления, способны вызывать, в частности, окислительную модификацию биополимеров, а также нарушать функциональные свойства и структуру тех или иных субклеточных и клеточных компонентов.

Основное количество потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции митохондриального окисления при котором на молекулу О2 происходит одновременный перенос четырех электронов с образованием двух молекул воды или эквивалентных соединений. Вместе с тем, во всех живых организмах постоянно протекают реакции одноэлектронного восстановления, которое приводит к образованию промежуточных продуктов восстановления молекулы кислорода. Эти соединения представляют собой группу различных веществ радикальной и нерадикальной природы, которые обладают высокой реакционной способностью, вследствие чего получили название активных форм кислорода. К ним относят: супероксидный анион – радикал (О2), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (OH), синглетный кислород (1О2), гипогалоиды (HOCl, НОCI, НОBr, НОI, НОSCN), оксид азота (NO) и др.

АФК образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью; радиолиз; фотолиз; термолиз (рис.1.1.1).




I – цитохром-с-оксидаза; II – флавиновые оксидазы; III – ксантиноксидаза; IV – NADPH – оксидаза; V – NO-синтаза; VI – реакция Фентона; VII – реакция Хабера-Вайса; VIII – воздействие радиации; IX – перекисное окисление липидов; X–неферментативное окисление гемоглобина; XI – каталаза; XII – миелопероксидаза.
Рисунок 1.1.1 – Основные пути и ферменты генерации АФК в организме человека и животных
Активные формы кислорода — это, с физико-химической точки зрения, прежде всего свободные радикалы, которые имеют на внешней электронной оболочке неспаренный электрон. АФК генерируются во всех частях клетки. 95–98% вдыхаемого О2 расходуется на выработку энергии и окислительный метаболизм субстратов, 2–5% О2 переходит в активные формы кислорода.

Средняя концентрация их в тканях человека составляет 10–8 мМ. Основные механизмы генерации АФК связаны с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей митохондрий или микросом, особенно при низкой концентрации АDP, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети.

Свободные радикалы отличаются от обычных молекул не только высокой химической активностью, но и тем, что порождают цепные реакции. "Отобрав" доступный электрон у оказавшейся рядом молекулы, радикал превращается в молекулу, а донор электрона – в радикал, который может продолжить цепь дальше.
Вопросы для самоконтроля

1. Активные формы кислорода – классификация, характеристика.

2. В каких процессах образуется супероксидный анион-радикал

3. Первичные радикалы кислорода.

4. Вторичные радикалы кислорода.

5. Третичные радикалы кислорода.

6. Реакция Хабера-Вейса.

7. NADPH-оксидазный комплекс – строение, биологическая роль.

8. Компартмент клетки, в котором образуется основное количество активных форм кислорода.

9. Оксидазные и оксигеназные реакции, в которых образуются АФК.

10. Генерация АФК при аутоокислении гемоглобина.
Тема 1.2. Окислительная модификация биомолекул активными формами кислорода

Процессы свободнорадикального окисления играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток, с одной стороны, это необходимый этап различных метаболических процессов, но с другой стороны, повышенная интенсивность свободнорадикальных процессов во многих случаях является либо следствием, либо причиной тех или иных патологических изменений в клетках и тканях. В ходе свободнорадикальных реакций образуется значительное количество продуктов радикальной и нерадикальной природы, часть из которых способна повторно вовлекаться в развитие и дальнейшее усиление интенсивности процессов свободнорадикального окисления. Свободнорадикальному окислению подвергаются липиды, белки, нуклеиновые кислоты и углеводы.

В первую очередь в биологических мембранах окислению подвергаются полиненасыщенные жирные кислоты в составе фосфолипидов. Перекисное окисление мембранных фосфолипидов является распространенным механизмом модификации и деструкции мембран, его усиление выявляется при развитии большого количества патологических состояний. В нормальной клетке эти процессы регулируются рядом ферментов: NАDР(Н)-зависимыми оксигеназами, циклооксигеназами и липоксигеназами. Продукты перекисного окисления липидов являются промежуточными продуктами синтеза простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и др.

Процесс ПОЛ осуществляется по механизму цепной реакции, которая приводит к накоплению различных липоперекисей – сравнительно устойчивых соединений. Последние вызывают нарушения упаковки мембраны и внедрение в области мембранных дефектов воды и других гидрофильных молекул. Из перекисного радикала может образоваться эндоперекисный радикал липида, распад которого приводит к формированию ряда продуктов, в том числе различных альдегидов (рис. 1.2.1). ПОЛ включает 3 стадии: инициация, распространение и терминация.





Рисунок 1.2.1. – Схематическое изображение свободнорадикального окисления ненасыщенной жирной кислоты и образующихся при окислении продуктов
Образовавшиеся при инициации пероксильные радикалы атакуют ненасыщенные цепи соседних жирных кислот, порождая цепную реакцию перекисного окисления и образования цитотоксичных перекисных радикалов RO· и R·, и диеновых коньюгатов. Особенно активно катализируют липидпероксидацию ионы железа Fe(III) и меди Cu(II): взаимодействуя с гидроперерекисями ROOH, они порождают алкоаксильные RO· и пероксильные ROO· радикалы. Гидроперекиси липидов приводят к повышению текучести мембраны, истечению растворенных в цитозоле веществ и потере функции мембранных белков. Активность ПОЛ зависит также от степени ненасыщенности мембранных ПНЖК. Продукты терминации ПОЛ – циклические гидро- и эндоперекиси распадаются до конечных продуктов: различных альдегидов, таких как малоновый диальдегид (МДА) и 4-гидроксиноненаль, которые могут атаковать аминокислоты боковых цепей белка и приводить к фрагментации ДНК. Продукты окисления, в частности митохондриальных мембран, могут

являться компонентами сигнальных путей апоптоза.


Вопросы для самоконтроля

1. Какими АФК запускается процесс ПОЛ?

2. Из каких стадий состоит процесс липопероксидации?

3. Каким образом происходит разветвление ПОЛ?

4. Как обрывается процесс перекисного окисления липидов?

5. Почему повышается текучесть мембран при ПОЛ?

6. Роль токоферола в поддержании липидного гомеостаза мембран.

7. Каким антиоксидантом токоферол поддерживается в восстановленном состоянии?

8. Какие продукты ПОЛ обладают прооксидантным действием?

9. Как можно определить уровень липопероксидации?

10. Механизм действия малонового диальдегида на белки и нуклеиновые кислоты.
Тема 1.3. Компоненты антиоксидантной системы и их характеристика.

Связывание и модификация АФК, предупреждение образования окисленных биомолекул осуществляется антиоксидантной системой, функционирующей как внутри клетки, так и вне её. Клеточная АОС представлена семейством оксидоредуктаз и трансфераз, найденных в цитоплазме, митохондриях и ядре клетки. Состав низкомолекулярных клеточных антиоксидантов достаточно обширен: восстановленный глутатион и аскорбиновая кислота находятся в водной фазе клетки, защищая компоненты цитозоля и матрикса митохондрий, токоферолы и каротиноиды защищают плазматическую и внутриклеточные мембраны. Защита ферментов и белков, в частности липопротеинов, присутствующих в плазме крови, осуществляется внеклеточной АОС. Эта антиоксидантная система, как и клеточная, характеризуется наличием антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных биоантиоксидантов и присутствует не только в плазме крови, но и в других биологических жидкостях организма.

Клеточная антиоксидантная система обеспечивает ограничение интенсивности реакций свободнорадикального окисления, защиту чувствительных к окислительным повреждениям мембран молекул, внутри- и внеклеточных структур от действия свободных радикалов, восстановление окислительных молекулярных повреждений. Такие процессы обеспечиваются разными путями, включающими предотвращение образования свободных радикалов, обезвреживание их посредством связывания.

В аэробных организмах сформировалась первичная и вторичная системы антиоксидантной защиты. Компоненты первичной системы взаимодействуют непосредственно с АФК на уровне клеток и тканей. К ним отнесены ферментативные и неферментативные звенья АОС. Компоненты вторичной защиты (липолитические ферменты, протеазы, пептидазы и т.д.) образуют систему, которая начинает функционировать при уже случившихся окислительных повреждениях клеточных структур, когда возникает необходимость быстрого их удаления и восстановления.

Ферментативная АОС включает ферменты супероксиддисмутазу (СОД), каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФДГ), глутатионпероксидазу (ГПО), глутатионредуктазу (ГР), глутатионтрансферазу (ГSТ).

Супероксиддисмутаза. Организмы различной степени сложности, утилизирующие кислород в процессах обмена веществ содержат ферменты, обладающие способностью дисмутировать супероксидные радикалы, обрывая тем самым опасную цепь свободнорадикальных превращений в самом зародыше. Эти ферменты называют супероксиддисмутазами (КФ 1.15.1.1., супероксид: супероксид оксидоредуктаза, СОД). Известно три типа СОД, для которых необходимо наличие Cu2+, Zn2+, Mn3+: медь-цинковая (Cu,Zn-СОД; СОД1), марганцевая (Мn-CОД; СОД2) и экстрацеллюлярная (Э-СОД; СОД3). СОД являются, в основном внутриклеточными ферментами и лишь небольшая часть СОД-активности обнаружена во внеклеточных жидкостях млекопитающих в виде гликозилированного тетрамера Cu,Zn-СОД с M.м. 135 кДа. Этот гликопротеин проявляет сродство к сульфатированным полисахаридам таким, как гепарин и гепарансульфат

Реакция дисмутации с участием Cu,Zn-СОД идёт в две стадии, в ходе которых происходит перенос электронов с одного супероксидного анион-радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди.

E- Cu2+ + O2 - + H+  E-Cu+ + O2


  1. Cu2+ + O2- + H+  E-Cu+ + H2O2

Супероксиддисмутазы обладают узкой субстратной специфичностью, действие их направлено только на полувосстановленную молекулу кислорода.

СОД может взаимодействовать также с пероксидом водорода и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов - супероксида и гидроксила:

Cu2+ -СОД + Н2О2  Сu+ -СОД + О2 + 2Н+;

Cu+ -СОД + Н2О2  Сu2+ -СОД + ОН + НО


Неорганические перекиси ингибируют СОД, необратимо восстанавливая медь в составе её активного центра. В отличие от неорганических липидные перекиси обратимо ингибируют СОД. Эффективным ингибитором фермента является гидроперекись линоленовой кислоты, снижающая её активность в 3,5 раза.

Супероксиддисмутаза играет важную роль в защите клеток от повреждающего действия супероксидного анион-радикала и по праву считается главным ферментом внутриклеточной АОС. СОД не только стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы перекисного окисления липидов. Снижая уровень О2, она защищает от его дезактивирующего действия каталазу и глутатионпероксидазу.

Регулирующее влияние на активность СОД оказывают глутатион, цистеин, другие SH-содержащие соединения, а также опосредованно ферменты глутатионового обмена; последние, наряду с каталазой и пероксидазами различной субстратной специфичности, обеспечивают детоксикацию пероксида водорода.

В процессе дисмутации супероксидного анион-радикала образуется перекись водорода, восстанавливаемая до воды в основном каталазой и глутатионпероксидазой



Каталаза. Каталаза (КФ 1. , пероксид водорода: пероксид водорода оксидоредуктаза) – хромопротеин с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4 субъединиц, имеющих по одной группе гема, локализуется в основном в пероксисомах, частично – в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к перекиси водорода и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация перекиси водорода высока, каталаза активно разрушает ее.

Разложение перекиси водорода каталазой осуществляется в два этапа:


Fe3+-каталаза + 2 H2O2 → окисленная каталаза + H2O2 → Fe3+-каталаза + H2O2 + O2.

При этом в окисленном состоянии каталаза работает как пероксидаза. Субстратами в пероксидазной реакции могут быть этанол, метанол, формиат, формальдегид и другие доноры водорода.

Следует отметить, что около 0,5% кислорода, образующегося в результате разложения перекиси водорода, возникает в возбужденном, синглетном состоянии и таким образом в процессе разложения перекиси водорода вновь генерируются активные формы кислорода.

Глутатионпероксидаза (КФ 1. 11.1.9 , глутатион: Н2О2 оксидоредуктаза, ГПО) важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). ГПО – гомотетрамерный селенопротеин, имеет молекулярную массу около 74 кДа, состоит из 4 идентичных субъединиц, в состав активного центра входит селен, который содержится в виде Se-цистеина. Селен необходим для синтеза глутатионпероксидазы. Сульфгидрильная группа глутатиона (ГSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу. Ген глутатионпероксидазы локализован в 3-й хромосоме. Глутатионпероксидаза катализирует реакции, в которых фермент восстанавливает пероксид водорода до воды, а также восстановление органических гидропероксидов (ROOH) до гидроксипроизводных, и в результате переходит в окисленную дисульфидную форму ГS-SГ:
2ГSH + H2O2 = ГS-SГ + H2O

2ГSH + ROOH = ГS-SГ + ROH +H2O


Глутатионпероксидаза обезвреживает не только H2O2, но и разные органические липидные пероксилы, которые образуются в организме при активации ПОЛ. Такие как гидропероксиды линолевой и линоленовой кислот, холестерин-7β-гидропероксид и некоторые синтетические вещества (кумен-, трет-бутил-гидропероксиды). Глутатионпероксидаза защищает от окислительной атаки белки, липиды, никотинамидные коферменты, восстанавливает липидные перекиси.

Фермент глутатионпероксидаза локализирован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. В тканях млекопитающих максимальная активность глутатионпероксидазы в печени, эритроцитах, надпочечниках. Активность фермента зависит от количества образованных пероксидов. Функционирует сопряженно с глутатионредуктазой. Фермент устойчив к действию цианида и азида, особенно в присутствии ГSH.



Главной ферментативной системой плазмы крови является ГПО внеклеточных жидкостей и ГПО гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфатидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности, восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации. Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл.

Глутатион-S-трансферазы. Глутатион-S-трансферазы (2.5.1.18, донор: восстановленный глутатион трансфераза, ГST) представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая: 1) каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с ГSH; 2) некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-гидропероксидов через экспрессию активности ГSH-пероксидазы. Кроме того, глутатион-S-трансферазы изомеризуют некоторые стероиды и простагландины, участвуют в метаболизме других эндогенных веществ. В частности, ГST могут вовлекаться в синтез лейкотриенов, поддерживая процесс воспаления.

Восстановленный глутатион (ГSH) – низкомолекулярный тиол, преобладающий (90–95%) во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1–10 ммоль) выше, чем концентрация большинства органических веществ. ГSH представляет собой трипептид (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин), состоящий из глицина, цистеина и глутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через карбоксильную группу.

Конъюгация ксенобиотиков с глутатионом катализируемая глутатион-S-трансферазой, осуществляется в основном тремя путями (рис. 4):

1) нуклеофильное замещение по электрофильным атомам С, N, S и Р.

2) присоединение к субстрату (алкены и эпоксиды) полной молекулы GSH ;

3) восстановление органических гидроперекисей до спиртов (селен-независимая глутатион-пероксидазная активность), характерная для GST класса альфа, в отличие от фермента глютатионпероксидазы).

При дальнейшем метаболизме глутатионовые конъюгаты переходят в меркаптуровые кислоты или меркаптаны и выводятся из организма (около 0,1 ммоль в сутки).

Рисунок 4 –Реакции, катализируемые глутатион-S-трансферазами


Вопросы для самоконтроля

1. Супероксиддисмутаза – строение, изоформы, мезанизм реакции.

2. В чем отличие экстрацеллюлярной СОД от цитозольного изофермента?

2. Какие ферменты входят в глутатионовую антипероксидную систему?

3. Как происходит окисление глутатиона?

4. В какой реакции происходит восстановление окисленного глутатиона? Какой кофермент требуется для этого процесса?

5. Глутатионпероксидаза – строение, изоформы, субстраты.

6. Два варианта участия глутатионпероксидазы в обезвреживании мембранных липопероксидов.

7. Глутатион-S-трансферазы. Классификация, строение, механизм действия.
Таблица 3 – Содержание тем лабораторных работ


п/п


Разделы

дисциплины



Лабораторные работы


Аудито-рные занятия

(часы)


Тема

1

Свободнорадикаль-ные процессы в биологических системах

1.1. Вводное занятие.

1.2. Определение содержания в биообразцах активных форм кислорода и азота

1.3. Влияние оксидативного стресса на содержание продуктов свободнорадикального окисления в эритроцитах, плазме крови и тканях экспериментальных животных

1.4. Влияние оксидативного стресса на состояние антиоксидантной системы в эритроцитах и плазме крови экспериментальных животных

1.5. Влияние оксидативного стресса на структурно-функциональное состояние мембраны эритроцитов экспериментальных животных

1.6. Итоговое занятие



4

8

8


8

8


4




4. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНОЙ АТТЕСТАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ
Для контроля самостоятельной работы студентов по дисциплине используются тесты, обсуждение отработанных на лабораторных занятиях методик, проработанного теоретического материала. Успешное освоение данного раздела большого практикума подготовит студентов к проведению научных исследований в области биохимии и молекулярной биологии как в плане теоретического понимания механизмов основных биохимических процессов, так и в плане практического применения этих знаний в дальнейшей деятельности.

Для промежуточного контроля проводятся две письменные контрольные работы. Контрольно-измерительные материалы предлагаются в нескольких вариантах и состоят из заданий и тестовых вопросов. После проведения промежуточного контроля на ближайшем лабораторном занятии подробно разбираются задания и вопросы, вызвавшие наибольшие затруднения. Промежуточный контроль проводится согласно графику, приведенному в приложении. Итоговая аттестация – зачет.


Перечень вопросов к зачету по разделу

«Свободнорадикальные процессы в биологических системах».

  1. Пути образования свободных радикалов в биологических системах.

  2. Основные свободные радикалы, образующиеся в клетках, их характеристика.

  3. Свободнорадикальные процессы в биологических системах: перекисное окисление липидов.

  4. Свободнорадикальные процессы в биологических системах: окислительная модификация белков и нуклеиновых кислот.

  5. Пути образования и деградации пероксида водорода в клетках.

  6. Методы определения содержания продуктов ПОЛ и окислительной модификации белков.

  7. Антиоксидантная система: характеристика компонентов неферментативного звена.

  8. Антиоксидантная система: характеристика компонентов ферментативного звена.

  9. Характеристика антиоксидантной системы плазмы крови.

  10. Антиоксидантная система эритроцитов.

  11. Антиоксидантная система лимфоцитов.

  12. Супероксиддисмутаза – ключевой фермент системы антиоксидантной защиты.

  13. Семейство глутатионпероксидаз, характеристика.

  14. Семейство глутатион-S-трансфераз, характеристика. Эритроциты: строение, метаболизм, физиологические функции.

  15. Глутатион. Редокс-цикл глутатиона.

  16. Компоненты глутатионовой антиоксидантной системы и их роль в защите клеток от оксидативного стресса.

  17. Лимфоциты: строение, метаболизм, физиологические функции.

  18. Методы определения активности антиоксидантных ферментов.

  19. Методы определения содержания низкомолекулярных антиоксидантов.

  20. Методы выделения эритроцитов и лимфоцитов из крови.

  21. Обработка экспериментальных данных (вычисление активности ферментов и концентрации метаболитов в биологических жидкостях и тканях).

  22. Токоферолы. Роль в защите мембранных липидов от оксидативного стресса.



БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Основная литература
1. Оценка структурно-функционального состояния клетки: метод. указания к практическим занятиям /сост.: Н.М. Титова, Т.Н. Замай, Т.Н. Субботина, А.А. Савченко. – Красноярск: ИПК СФУ, 2009. – 60 с. – 43 экз.

2. Современные аппаратура и методы исследования биологических систем /под ред. Э.Дж. Сински и Т.Г. Воловой. – Красноярск: Сибирский федеральный ун-т, Институт биофизики СО РАН, 2011. – 480 с. (28 экз., кафедра медицинской биологии)


Дополнительная литература
3. Барабой В.А. Брехман И.И., Голожин В.А. с соавт. Перекисное окисление и стресс. - М.: Наука, 2004. - 148 с.

4. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембранология – Петрозаводск: Издательство Кар НЦ РАН, 2006.– 226 с.

5. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники, 2000. – Т. 29. - С. 151-167.

6. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. – М.: Мир, 1983. – 376 с.

7. Керридж Д., Типтон К. Биохимическая логика. – М.: Мир, 1974. -327с.

8. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.

9. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В. с соавт. Свободнорадикальное окисление и старение. - СПб.: Наука, 2003. - С. 10-122.


Электронные ресурсы

1. Nelson D.L., Cox M.M. Leninger Principles of Biochemistry (Fourth Edition). Электронный ресурс (www.Molbiol.ru).

2. www.virginia.edu.

3. www.dehydrogenase.com.

4. www.ncbi.nlm.nih.gav.

5. www.molbiol.ru.

6. www. high.stanford.edu.

7. www.wikipedia.org.

Приложение

ГРАФИК
учебного процесса и самостоятельной работы студентов по дисциплине Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах», специальность 020208.65 - Биохимия, института ИФБиБТ, 4 курса на 7 семестр





п/п

Наименование

дисциплины

Семестр

Число аудиторных занятий

Форма

контроля

Часов на самостоятельную работу

Недели учебного процесса семестра

Всего

По видам

Всего

По видам

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

1

Большой практикум

Раздел. Свободнорадикальные процессы в биологических системах



7

40

Лабораторные работы – 40

зачет

5

ТО - 5

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ТО

ПК














ПК



















ПК













Условные обозначения: ТО – изучение теоретического курса; ПК – промежуточный контроль (тестирование).

ОГЛАВЛЕНИЕ




Общие сведения

3

1.

Трудоемкость дисциплины

4

2.

Структура самостоятельной работы

5

3.

Методика реализации самостоятельной работы

5

4.

Методика проведения промежуточной аттестации по самостоятельной работе

15




Библиографический список

16




Приложение

18

Учебное издание

Титова Н.М.

Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе

Редактор И.О. Фамилия

Корректор И.О.Фамилия

Компьютерная верстка: И.О.Фамилия


Подписано в печать (дата) 2011 г. Формат 60х84/16. (А5)

Бумага офсетная. Печать плоская.

Усл. печ. л. ?? (количество страниц/16). Уч.-изд. л. ? ?.

Тираж 100 экз. Заказ ????. (Дает РИО)

Редакционно-издательский отдел

Библиотечно-издательского комплекса

Сибирского федерального университета

660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79

Тел/факс (391) 244-82-31. E-mail rio@sfu-kras.ru



http://rio.sfu-kras.ru

Отпечатано Полиграфическим центром

Библиотечно-издательского комплекса

Сибирского федерального университета



660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а





Достарыңызбен бөлісу:


©kzref.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет